趙衛(wèi)星，康利允，高寧寧，梁 慎，常高正，徐小利,李海倫，王慧穎，李曉慧

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)病在我國(guó)西瓜產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，是嚴(yán)重危害我國(guó)西瓜生產(chǎn)的主要病害之一[1]，一般可造成減產(chǎn)15%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%左右，甚至絕收[2]。相關(guān)研究表明，植物受到病原物侵染后會(huì)發(fā)生一系列由生物活性酶調(diào)控的生理生化變化，這種酶活性的變化一定程度上反映了寄主與病原的互作關(guān)系[3-5]。毛愛(ài)軍等[6]研究認(rèn)為，辣椒幼苗受到疫病病原菌侵染后引起體內(nèi)相關(guān)防御酶活性的變化來(lái)抵抗病菌侵染；鄒芳斌等[7]研究認(rèn)為，黃瓜枯萎病抗性與防御系統(tǒng)中幾種酶活性密切相關(guān)。在茄子黃萎病[8]、大豆病毒病[9]、甜瓜蔓枯病[10]和水稻白葉枯病[11]等作物病害的研究中，利用防御酶含量或活性水平變化作為抗病性鑒定的生化指標(biāo)已有相關(guān)報(bào)道。目前，有關(guān)西瓜ZYMV的研究多集中在病毒檢測(cè)、抗性資源與品種鑒定、抗性基因的分子標(biāo)記等方面[12-14]，而防御酶活性與西瓜抗ZYMV的關(guān)系研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，以抗性不同的西瓜品系為材料，采用摩擦法人工接種ZYMV，測(cè)定接種后西瓜葉片相關(guān)防御酶活性的變化，探討病變過(guò)程中防御酶活性的變化與西瓜品系抗性之間的關(guān)系，篩選抗性鑒定指標(biāo)，為進(jìn)一步闡明西瓜抗ZYMV機(jī)制并進(jìn)行合理的生理調(diào)控以及抗性資源快速評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試西瓜品系：野生西瓜PI595203(高抗小西葫蘆黃花葉病毒病，HR)，從美國(guó)先正達(dá)種子公司引進(jìn)；W18-18(抗小西葫蘆黃花葉病毒病，R)、18-268-2(感小西葫蘆黃花葉病毒病，S)是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所通過(guò)室內(nèi)人工接種和田間病圃法鑒定得到的抗、感品系。

供試病毒：小西葫蘆黃花葉病毒，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所彭斌博士提供。

1.2 方法

挑選飽滿(mǎn)一致的西瓜種子，55 ℃溫湯浸種6 h，用濕毛巾包裹置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，為保證出苗一致性，野生西瓜種子先人工破殼再催芽；待種子露白后選擇芽長(zhǎng)基本一致的種子播種于裝有滅菌基質(zhì)[V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶1]的32孔穴盤(pán)中，在25～28 ℃溫室內(nèi)育苗，子葉生長(zhǎng)期內(nèi)每7 d澆灌一次1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，真葉展出后每隔4～5 d澆灌一次Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，采用人工摩擦法接種ZYMV，以不接種ZYMV為對(duì)照(CK)，3個(gè)品系共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。育苗期間溫度和光照按常規(guī)育苗管理進(jìn)行。

1.3 防御酶活性測(cè)定

分別于接種后0、2、4、6、8、10 d取接種部位的葉片進(jìn)行相關(guān)酶活性測(cè)定，每個(gè)處理隨機(jī)取5株，重復(fù)3次。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法，過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定采用鄰苯二酚法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定采用苯丙氨酸法，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法，以上各種酶活性測(cè)定均參照趙世杰[15]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013和DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖，采用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性西瓜品系葉片SOD活性變化

3種不同抗性西瓜品系未接種處理葉片SOD活性在各處理時(shí)期無(wú)顯著性差異，接種ZYMV后，葉片SOD活性均顯著升高(圖1)。其中，高抗和抗性品系葉片SOD活性增加迅速，在接種后第4天達(dá)到高峰，分別比對(duì)照提高29.80%和23.72%，且高抗品系顯著高于抗性和感病品系；感病品系葉片SOD活性在接種后第6天達(dá)到峰值，比對(duì)照提高14.29%，顯著低于高抗品系，與抗性品系間差異不顯著。隨接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片SOD活性變化幅度逐漸縮小?？梢?jiàn)，ZYMV可誘導(dǎo)提高SOD活性抵抗病源的侵染，3個(gè)品系葉片SOD系統(tǒng)響應(yīng)的快慢順序依次為高抗、抗性、感病。

2.2 不同抗性西瓜品系葉片POD活性變化

不同抗性西瓜品系葉片POD活性變化有明顯差異(圖2)。由圖2可見(jiàn)，未接種ZYMV處理，高抗和抗性品系西瓜葉片POD活性在各個(gè)處理時(shí)期均高于感病品系，但差異未達(dá)顯著水平；接種ZYMV后，不同抗性品系葉片POD活性均顯著升高，高抗和抗病品系升高幅度高于感病品系，高抗和抗性品系在接種后第4 天達(dá)到峰值，分別比對(duì)照升高63.44%、58.13%；感病品系在接種后第6 天達(dá)到峰值，比對(duì)照提高50.42%。說(shuō)明高抗西瓜品系葉片POD系統(tǒng)較為敏感，對(duì)病原物的刺激反應(yīng)迅速，抗性品系次之，感病品系反應(yīng)能力相對(duì)較弱。

2.3 不同抗性西瓜品系葉片CAT活性變化

不同抗性西瓜品系葉片CAT活性對(duì)ZYMV刺激的響應(yīng)有明顯差異(圖3)。高抗和抗性品系葉片CAT活性在接種后第4天達(dá)到峰值，分別比對(duì)照提高55.62%和43.98%；感病品系在接種后第6天達(dá)到峰值，比對(duì)照提高39.78%。未接種處理，高抗和抗性品系葉片CAT活性均略高于同時(shí)期的感病品系，差異不顯著，接種后在多個(gè)測(cè)定時(shí)期內(nèi)差異達(dá)顯著水平。接種后第10天，感病品系葉片CAT活性為12.84 U/g，分別為高抗、抗性品系的75.23%、80.06%?？梢?jiàn)，接種ZYMV可顯著誘導(dǎo)提高西瓜葉片的CAT活性，高抗和抗性品系啟動(dòng)CAT系統(tǒng)早于感病品系。

2.4 不同抗性西瓜品系葉片PAL活性變化

由圖4可見(jiàn)，未接種處理，感病品系西瓜葉片PAL活性略低于高抗和抗性品系，但差異未達(dá)顯著水平；接種ZYMV后，不同抗性西瓜品系均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，且高抗品系顯著高于感病品系；高抗、抗性品系均在接種后第2天達(dá)到峰值，分別比對(duì)照提高了31.63%、19.35%，接種后第4天與第2天差異均不顯著，直到第6天急速下降；感病品系在接種后第4天達(dá)到峰值，比對(duì)照提高15.91%，隨后急速下降，再趨于平穩(wěn)。總體來(lái)看，不同抗性西瓜品系接種ZYMV均可顯著提高葉片PAL活性，高抗和抗性品系PAL活性出現(xiàn)的峰值早于感病品系，且PAL活性變化幅度大于感病品系。

2.5 不同抗性西瓜品系葉片PPO活性變化

由圖5可見(jiàn)，未接種處理，3種不同抗性西瓜品系葉片PPO活性無(wú)顯著差異，接種后葉片PPO活性迅速升高，高抗品系葉片PPO活性至接種第4天達(dá)到最大值，比對(duì)照升高35.77%，顯著高于抗性、感病品系；抗性和感病品系葉片PPO活性在接種后第6天達(dá)到峰值，分別比對(duì)照提高25.74%和7.65%；在整個(gè)處理時(shí)期，3種不同抗性西瓜品系葉片PPO活性增幅無(wú)明顯規(guī)律性。可見(jiàn)，接種ZYMV可顯著提高西瓜葉片PPO活性，高抗品系對(duì)病原菌感知能力較強(qiáng)，較早提高PPO活性以抵抗病原菌的侵染。

3 結(jié)論與討論

在植物抗病反應(yīng)中，一些防御酶類(lèi)起著重要的調(diào)控作用[16]，生物酶活性變化一定程度上反映寄主與病原的互作關(guān)系，通常植物通過(guò)提高相關(guān)防御酶的活性阻擋病原菌的侵染，從而提升自身的抗病性。本研究結(jié)果顯示，3種不同抗性的西瓜品系接種ZYMV后，葉片SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均顯著升高，可能是接種病原菌后激活了植株體內(nèi)酶活性基因的表達(dá)，使植物自身對(duì)病菌侵染產(chǎn)生抗性反應(yīng)，以適應(yīng)不良逆境條件。這與陳亮等[17]對(duì)西瓜枯萎病和孫慶科等[18]對(duì)茄子黃萎病的研究結(jié)果一致。植株與病原菌的抗?fàn)幨且粋€(gè)復(fù)雜的過(guò)程，研究認(rèn)為，防御酶活性變化是寄主自身抗病性的一種體現(xiàn)，或是抵抗病原菌侵染過(guò)程中的一種伴生現(xiàn)象[19-20]，但其具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

植物抗病性的強(qiáng)弱取決于體內(nèi)抗性基因表達(dá)后抗病反應(yīng)的速度和抗病物質(zhì)的積累量[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)防御酶活性的變化因品系抗性不同而表現(xiàn)出明顯差異，高抗和抗病品系葉片SOD、POD、CAT、PAL活性達(dá)到峰值的時(shí)間均早于感病品系，且高抗和抗病品系活性較對(duì)照增幅大，感病品系的活性增幅較小，可能是抗性品系對(duì)病原物的刺激反應(yīng)迅速，較早地啟動(dòng)了防御酶系統(tǒng)，提高防御酶活性以抵抗病原菌的侵染；感病品系雖然也有一定的防御能力，但其反應(yīng)速度及強(qiáng)度較弱。這與史鳳玉等[22]對(duì)野生大豆花葉病毒、陳亮等[17]對(duì)西瓜枯萎病和李淼等[23]對(duì)獼猴桃潰瘍病的研究結(jié)果相似。說(shuō)明這4種酶活性水平與西瓜對(duì)ZYMV的抗性密切相關(guān)，是其抗病的一個(gè)重要因素。李振岐等[24]對(duì)小麥銹病的研究認(rèn)為，植物所含抗病基因和遺傳背景的差異，可以通過(guò)體內(nèi)防御性酶活性的變化來(lái)反映。因此，可將這4種酶活性增幅和峰值出現(xiàn)時(shí)間的早晚作為西瓜抗ZYMV的鑒定指標(biāo)，以快速評(píng)價(jià)出不同西瓜品系對(duì)小西葫蘆黃花葉病毒病的抗性水平。

PPO在植物抗病反應(yīng)中參與酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，促進(jìn)木質(zhì)素和醌類(lèi)物質(zhì)的形成，從而導(dǎo)致病毒擴(kuò)展受阻[25]。本研究結(jié)果顯示，接種ZYMV后，高抗品系葉片PPO活性出現(xiàn)峰值的時(shí)間早于感病品系，可能高抗西瓜品系PPO系統(tǒng)對(duì)病原菌的感知能力較強(qiáng)，加速木質(zhì)素形成和醌類(lèi)物質(zhì)積累。這與史鳳玉等[22]對(duì)野生大豆花葉病毒和張建軍等[26]對(duì)小麥梭條花葉病毒的研究結(jié)果一致。而馬艷玲等[27]研究則認(rèn)為，黃瓜接種枯萎病菌后PPO活性無(wú)明顯變化，造成這種差異的原因可能與所選品系自身的抗病性有關(guān)，本研究中抗性品系葉片PPO活性增幅無(wú)明顯的規(guī)律性，也這證實(shí)了這一點(diǎn)；酶促反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，也可能與作物酶系統(tǒng)參與不同病害侵染應(yīng)答機(jī)制差異有關(guān)，其具體原因還有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，西瓜品系葉片SOD、POD、PAL、CAT、PPO活性越高，抗ZYMV能力越強(qiáng)；高抗和抗性品系的葉片SOD、POD、CAT、PAL活性出現(xiàn)的峰值時(shí)間和峰值期酶活性增幅均高于感病品系，這4種酶活性變化與西瓜病毒病抗性密切相關(guān)，在抗病生理機(jī)制中起重要作用，其酶活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間及增幅大小可作為西瓜ZYMV抗性篩選的重要生理指標(biāo)。