唐仙英，龐文穎，海力，滕雪，張楠，朱順

(中南民族大學 生命科學學院 & 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室 &生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

紡錘體是在有絲分裂過程中驅(qū)動染色體分離的細胞器. 在不對稱性分裂的細胞中，紡錘體的正確定位還決定兩個子細胞的命運[1]. 目前的研究已從細胞皮層、動力蛋白和星體微管網(wǎng)絡(luò)等方面對紡錘體定位的機理進行了闡釋[2]. 在模式生物芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)中，已知的調(diào)控紡錘體定位的重要通路有兩條：一條由動力蛋白Dynein介導，另一條由Kar9介導[3]. 二者在不同階段調(diào)控紡錘體的定位，其中Kar9通路負責將短紡錘體從母細胞移向母-芽頸，而Dynein通路則負責將紡錘體通過母-芽頸拉入子細胞[4-5].

在Dynein通路中，動力蛋白Dynein先結(jié)合于星體微管正端，在隨微管擺動過程中被細胞皮層上的Num1蛋白(Nuclear migration 1)捕獲并激活，這一過程稱為卸載；然后Dynein通過水解ATP向星體微管負端運動并產(chǎn)生拉力，使紡錘體和細胞核穿過母-芽頸而從母細胞轉(zhuǎn)移到子細胞中[6]，這一過程稱為核遷移.

Num1是Dynein在細胞皮層上的錨定蛋白.NUM1基因缺失將使細胞核向子細胞的轉(zhuǎn)移失敗，導致雙核細胞的產(chǎn)生[7]. Num1蛋白是一個由多結(jié)構(gòu)域組成的約313 kD的大分子蛋白，它在質(zhì)膜上成簇分布，其C末端的PH結(jié)構(gòu)域與質(zhì)膜上的4,5-二磷酸磷脂?；?PI4,5P2)結(jié)合，由此將Num1定位在質(zhì)膜上. 同時，其N末端的CC結(jié)構(gòu)域與線粒體膜上的心磷脂結(jié)合，使Num1和線粒體相連[8].

Sik1(suppressors of IκB)，別名Nop56[9]，是一種進化保守的核仁蛋白，參與rRNA的加工過程[10]. 有研究表明，過表達SIK1基因的細胞比同樣條件下培養(yǎng)的野生型細胞體積大5%左右，且G1期進程縮短，但有絲分裂進程延長[11]，這是因為過表達SIK1破壞了微管的功能，使紡錘體定位受損. 但是，該紡錘體定位受損是否足以影響核遷移，以及Sik1是否在Kar9或Dynein通路中扮演角色，目前還未知. 本實驗室通過Num1的CC結(jié)構(gòu)域的Pull down實驗篩選出了一系列Num1的互作蛋白[12]，Sik1是其中一員，因此推測二者可能存在功能關(guān)系. 本研究將從這一觀點出發(fā)，檢測Sik1在核遷移中的作用及與Num1的功能關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme)；魚精DNA (Invitrogen)；凝膠回收試劑盒 (OMEGA)；DMSO (Sigma)；G418 (上海生工)；PVDF膜 (Immobilon?-P Membrane, 0.45 μm)；Zymolase (ZYMO research)；鼠源HA抗體、GFP抗體(Genescript).

孢子解離顯微操作儀(MSM400，英國Singer)，珠磨式細胞破碎儀(Mini Bead Beater-16, 美國BioSpec)；微量冷凍離心機(FC5515R, 美國OHAUS)；顯微鏡(BX53，日本Olympus).

1.2 質(zhì)粒與酵母菌株

本實驗中所用的菌株見表1. 所用質(zhì)粒為pFA6a-kanMX6-GAL1p-3HA[13], pBJ1351(pRS305:Tub1-GFP).

表1 本實驗所用酵母菌株Tab.1 Yeast strains used in this study

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基，SC(synthetic complete)培養(yǎng)基參照LONGTINE 等[13],YPG培養(yǎng)基用半乳糖取代蔗糖，其他同YPD培養(yǎng)基. 用于誘導二倍體細胞減數(shù)分裂的SPM培養(yǎng)基為：酵母提取物 1 g/L, CSM 0.2 g/L, 蔗糖 0.5 g/L, 醋酸鉀 10 g/L.

1.4 SIK1基因過表達菌株的構(gòu)建

PCR擴增待轉(zhuǎn)化片段：利用PCR反應(yīng)從質(zhì)粒pFA6a-kanMX6-PGAL1-3HA[13]上擴增KanMX6-GAL1p-3HA片段，上游引物Tang130，下游引物Tang131，引物序列見表2，使用50 μL體系進行擴增：ddH2O 18 μL; 2×SF Buffer 25 μL; 模板50～400 ng; Tang130 (10 μM) 2 μL; Tang131 (10 μM) 2 μL; dNTPs mixture 1 μL; Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL. PCR反應(yīng)程序為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，45 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，2個循環(huán)；98 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，33個循環(huán)；72 ℃ 8 min；12 ℃保存.

表2 引物序列Tab.2 Sequence of primers

回收目的片段：將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，切下目的條帶回收.

制備YWL36的感受態(tài)細胞及轉(zhuǎn)化：采用醋酸鋰程序制備感受態(tài)細胞并轉(zhuǎn)化[13]. 轉(zhuǎn)化細胞涂布于含G418的YPG固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后將細胞復制于新的含G418的YPG固體培養(yǎng)基，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至長出克隆.

克隆鑒定：挑取數(shù)個單克隆在新的YPG固體培養(yǎng)基上劃線兩次，將最終得到的單克隆接種至3 mL YPG液體培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)期，提取總蛋白，進行Western blot檢測.

1.5 TCA(三氯乙酸)法提取總蛋白

TCA法提取總蛋白參照Tang[14]等.

1.6 蛋白免疫印跡分析

蛋白樣品用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離[15]，轉(zhuǎn)印至PVDF蛋白膜，用抗體孵育后在凝膠成像儀成像.

1.7 低溫雙核實驗及DAPI染色

參照Tang等[16]方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 SIK1基因過表達菌株的構(gòu)建

已有研究表明，SIK1是一個必需基因，缺失可導致細胞死亡，因此為了檢測Sik1蛋白在有絲分裂過程中的功能，本研究構(gòu)建了過表達SIK1的菌株. 首先通過PCR從質(zhì)粒pFA6a-kanMX6-GAL1p-3HA上擴增KanMX6-GAL1p-3HA片段(圖1(a))，片段回收后再轉(zhuǎn)化到野生型(YWL36)感受態(tài)細胞中，涂布于含G418的YPG平板上，24 h后復制一次至相同的培養(yǎng)基上. 當復制平板上長出單克隆時挑取5個在新YPG平板上劃線2次得到純化的單菌落，在液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)并提取總蛋白進行Western分析(圖1(b)). 結(jié)果顯示第1、2、3、5號克隆表達與預測尺寸相符的GAL1p-3HA-Sik1蛋白. 選取其中兩個克隆提取基因組DNA， 通過PCR擴增標記位點片段送去測序(圖1(c)). 測序結(jié)果標明這兩個克隆均成功發(fā)生基因重組，即GAL1啟動子已替換SIK1的內(nèi)源啟動子，SIK1過表達菌株KanMX6-GAL1p-3HA-SIK1構(gòu)建成功，命名為YT125.

圖1 KanMX6-GAL1p-3HA-SIK1菌株的構(gòu)建Fig.1 The construction of KanMX6-GAL1p-3HA-SIK1 strain(a)PCR擴增片段 KanMX6-GAL1p-3HA，1～4為同一片段，M為Marker；(b) Western blot分析檢測GAL1p-3HA-Sik1蛋白的表達，1～5為不同的克隆，6為未標記的陰性對照；(c) PCR擴增KanMX6-GAL1p-3HA標記位點片段用于測序，1～2為不同的克隆

為觀察紡錘體，將質(zhì)粒pRS305:GFP-TUB1轉(zhuǎn)化到Y(jié)T125細胞中，獲得GAL1p-3HA-SIK1GFP-TUB1菌株，命名為YT139.

2.2 SIK1基因過表達菌株的雙核比率及紡錘體定位分析

為了比較過表達SIK1的菌株YT139 (GAL1p-3HA-SIK1GFP-TUB1 )，缺失NUM1的菌株YT151 (num1ΔGFP-TUB1)，以及野生型菌株YWL1993 (GFP-TUB1 )中的紡錘體定位及核分裂，細胞于12 ℃培養(yǎng)16 h以促進雙核細胞的產(chǎn)生. 一部分細胞用于提取總蛋白進行Western blot分析確認蛋白的表達，另一部分細胞用70%酒精固定后用于DAPI染色觀察細胞核，或者用熒光顯微鏡觀察紡錘體. 如圖2所示，Western blot分析確認了3個菌株中GFP-Tub1以及YT139菌株中GAL1p-3HA-Sik1的表達.

1)num1Δ GFP-TUB1(YT151)；2)GAL1p-3HA-SIK1 GFP-TUB1 (YT139)；3)GFP-TUB1(YWL1993).圖2 Western blot分析確認菌株的蛋白表達Fig.2 Western blot analysis to confirm protein expression in strains indicated

在芽殖酵母的有絲分裂中，紡錘體在從母細胞轉(zhuǎn)移到子細胞之前，先要與母-子細胞極軸平行排列極軸示意圖見圖3(a). 為了檢測過表達SIK1對此階段紡錘體定位的影響，在熒光顯微鏡下觀察了細胞中的GFP-TUB1信號(圖4，中間列)，然后用Image J對位于母細胞中的短紡錘體偏離極軸的角度β進行了測量(圖3(a)). 3個菌株中β角的測量結(jié)果如圖3(b)所示，其中野生型細胞中紡錘體偏離角度的平均值為32.4°[(32.4±24.5)，圖3(b)，n=80]，num1Δ細胞為41.1°[(41.1±24.5)，圖3(b)，n=40]，而GAL1p-3HA-SIK1細胞為48.0°[(48.0±29.7°)，圖3(b)，n=59]. 獨立樣本t檢驗結(jié)果表明，GAL1p-3HA-SIK1細胞與野生型細胞存在極顯著差異(P<0.001)，而GAL1p-3HA-SIK1與num1Δ細胞間，以及num1Δ與野生型細胞間的差異不顯著(P>0.01). 此結(jié)果說明過表達SIK1干擾紡錘體在有絲分裂前期沿母-子細胞軸的排布，與相關(guān)報道一致[11].

圖3 過表達Sik1影響紡錘體沿母-子極軸的排布Fig.3 Overexpressing Sik1 affects the spindle alignmentalong the mother-bud axis of polarization(a)紡錘體偏離極軸示意圖；(b) 不同菌株母細胞中的紡錘體偏離極軸的角度, 箱線圖中的“x”表示平均值位置

觀察各突變體細胞中的核分裂，num1Δ菌株顯示了大量的雙核細胞，這些細胞的母細胞中含有兩個細胞核(圖4(c))，其雙核細胞的比率為16.4%(n=159). 野生型菌株中沒有觀察到雙核細胞(圖4(a)，n=133). 在GAL1p-3HA-SIK1菌株中，從193個細胞中僅發(fā)現(xiàn)1個雙核細胞(未顯示)，雙核細胞比率為0.5%(注：圖4b所示非雙核細胞，右下角白色箭頭所指細胞核為鄰近細胞的細胞核). 此外，觀察到num1Δ的雙核細胞中母細胞體積變大，呈延長的橢圓形，且紡錘體在母細胞內(nèi)部延長(圖4(c))，而GAL1p-3HA-SIK1和野生型菌株中鮮有此形態(tài)的細胞，進一步證實這兩個菌株沒有或極少產(chǎn)生雙核細胞. 上述結(jié)果表明，過表達SIK1導致紡錘體定位出現(xiàn)一定程度的缺陷，但不足以導致雙核細胞的形成.

圖4 各菌株中的紡錘體定位及核分裂Fig.4 Spindle orientation and nuclear division in the indicated strains(a) GFP-TUB1 (YWL1993 )；(b) GAL1p-3HA-SIK1 GFP-TUB1 (YT139 )；(c) num1Δ GFP-TUB1 (YT151)

2.3 Sik1蛋白與Kar9和Dynein通路的功能關(guān)系探索

在芽殖酵母中，控制紡錘體定位的兩條通路(即Kar9和Dynein)如果同時缺失或異常，將導致細胞生長緩慢或不能生長[5,16]. 由于Sik1蛋白過表達對紡錘體定位有一定程度的干擾，為明確Sik1參與了哪一條通路，檢測了過表達SIK1對NUM1缺失突變體或KAR9缺失突變體細胞生長的影響.

首先分別將kar9Δ或num1Δ單倍體菌株與GAL1p-3HA-SIK1單倍體菌株雜交，得到同時過表達SIK1和缺失NUM1(或KAR9)的菌株.

接下來將野生型、GAL1p-3HA-SIK1、num1Δ、GAL1p-3HA-SIK1num1Δ、kar9Δ、GAL1p-3HA-SIK1kar9Δ菌株分別培養(yǎng)至對數(shù)期，然后按濃度梯度滴種在含有半乳糖的培養(yǎng)基上以誘導GAL1p-3HA-SIK1的表達. 從圖5(a)可以看出，培養(yǎng)于30 ℃時，這些菌株的生長狀況相似，GAL1p-3HA-SIK1和num1Δ(或kar9Δ)的雙突變體與各自的單突變體生長狀況也相似，說明在正常生長溫度條件(30 ℃)下，SIK1的過表達不影響kar9Δ和num1Δ細胞的生長.

最后，為了研究溫度脅迫條件下過表達SIK1對kar9Δ和num1Δ細胞生長的影響，分別比較了各菌株在16 ℃和37 ℃的生長. 如圖5(c) 所示，各菌株在37 ℃時的生長狀態(tài)無明顯差別. 但在16 ℃低溫條件下，kar9Δ細胞的生長狀況優(yōu)于野生型及其他各組細胞(圖5(b)， 第5行).kar9ΔGAL1p-SIK1 雙突變體的生長不及kar9Δ菌株(圖5(b)，第6和第5行)，而num1ΔGAL1p-SIK1 雙突變體的生長則略好于num1Δ單突變體(圖5(b)，第4和3行). 因此，在低溫脅迫下，SIK1的過表達降低了kar9Δ細胞的活力，但卻能使num1Δ細胞恢復部分活力. 這些結(jié)果表明，Sik1可能在Dynein/Num1通路中扮演角色.

圖5 各菌株在不同溫度下的生長Fig.5 Growth of indicated strains at different temperatures(a) 梯度稀釋的細胞在30 ℃培養(yǎng)；(b) 梯度稀釋的細胞在16 ℃培養(yǎng)；(c) 梯度稀釋的細胞在37 ℃培養(yǎng)

3 討論

Sik1蛋白是本實驗室前期通過體外蛋白結(jié)合實驗和質(zhì)譜分析鑒定出的控制紡錘體定位的關(guān)鍵蛋白Num1的互作蛋白[12]. 已有報道和本研究均發(fā)現(xiàn)，過表達Sik1干擾紡錘體定位. 但本研究未能在過表達Sik1的菌株中檢測到大量雙核細胞. 可能有如下兩個可能性：(1)過表達Sik1雖然導致紡錘體異常，但細胞由于某種原因(例如存在其他功能重疊的因子)得以在后期修復該異常，因而避免了雙核細胞的產(chǎn)生；(2)Sik1蛋白過表達的水平不夠高，不足以導致雙核細胞的產(chǎn)生，本實驗Western分析的結(jié)果支持這一可能性(圖2). 后續(xù)研究中可能考慮相反的策略，即條件性限期滅活或降解Sik1蛋白檢測其對核遷移的影響，以評價Sik1在核遷移中的作用.

過表達Sik1一定程度拯救了num1Δ細胞在16 ℃的生長，但卻使kar9Δ細胞的生長變差. 這個結(jié)果進一步證明Sik1在紡錘體定位中扮演了一定角色，且有可能與Num1具有協(xié)作功能，更詳細的作用機制有待進一步研究.