王潔，趙信科，李應(yīng)東，劉凱*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

0 引言

當歸補血湯始載于《內(nèi)外傷辨惑論》，出自金元四大家之一李東垣之手[1]，由黃芪和當歸兩味中藥以5∶1比分組成，為補氣生血之基礎(chǔ)方，應(yīng)用廣泛。黃芪具有益氣固表，托毒排膿之效，正氣得復，毒邪則出，與藥理學研究認為黃芪具有促進NK細胞活性、增強中性粒細胞及巨噬細胞吞噬功能從而提高機體免疫力，并減輕有毒藥物的毒性作用一致[2]。當歸具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛之功，現(xiàn)代實驗研究證明當歸具有改善血液系統(tǒng)活力等作用[3]。方中重用黃芪一為補氣而固表，即“有形之血不能速生，無形之氣所當急固”之理，二為有形之血生于無形之氣，故用黃芪大補脾肺之氣，以資化源，使氣旺血生，配以當歸養(yǎng)血和營，則浮陽斂收，陽生陰長，用于治勞倦內(nèi)傷，陰血虧虛，陽浮于外之虛熱證。近年來，隨著對當歸補血湯研究的深入，其應(yīng)用范圍不斷增大，已有文獻證明從當歸補血湯在血液系統(tǒng)[4]、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)[5]等的運用，其治療心血管疾病主要是集中在抗心力衰竭、抗動脈硬化、抑制心肌細胞凋亡、減輕心肌纖維化[6]等方面。但由于中藥復方有效成分復雜，可以通過多成分、多途徑、多靶點、協(xié)同來發(fā)揮藥效，因此當歸補血湯治療放射性心肌損傷的作用機制仍有待進一步闡明。

近年來，隨著胸部惡性腫瘤如食管癌、肺癌、乳腺癌、縱隔腫瘤的發(fā)生率不斷增高，胸部放射治療成為其治療的主要治療措施，而鄰近縱隔的心臟在放療時會不可避免地受到影響，引起不同程度的心臟損傷[7-8]。主要包括放射后心包損傷、心肌損傷(radiationinduced heart disease，RIHD) 、冠狀動脈損傷、心臟傳導系統(tǒng)損傷及心臟瓣膜損傷等，統(tǒng)稱為放射性心臟損傷或放射性心臟病[9-10]。研究表明，經(jīng)放射治療后的腫瘤患者患冠心病、心臟瓣膜病、心包疾病、猝死等疾病的風險增加[11]。傳統(tǒng)醫(yī)學中的未病防治，增強機體正氣，防御外邪是早期防治癌毒的方法，其在腫瘤的早期防治、減輕患者放化療后副作用及改善生活質(zhì)量方面具有一定的優(yōu)勢，即中醫(yī)所說的減毒增效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種基于系統(tǒng)生物學理論分析藥物作用機制的網(wǎng)絡(luò)分析方法，具有整體性優(yōu)勢。它旨在從系統(tǒng)生物學、生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度解釋疾病的產(chǎn)生及從整體、從分子層面認識藥物的作用機制[12]。中藥復方治療疾病的作用機制十分復雜，具有多成分、多途徑和多靶點等優(yōu)勢，與中醫(yī)的整體觀念相當契合[13]。當前在中醫(yī)藥領(lǐng)域運用網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中藥復方的作用機制已成為趨勢，大量研究均已取得了優(yōu)秀的成果[14-16]。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，從分子角度證實當歸活血湯治療RIHD的可能活性成分，為后續(xù)中藥復方的研究、臨床新藥的開發(fā)提供可借鑒的思路與方法。

1 資料與方法

1.1 當歸補血湯的成分及作用靶點篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺網(wǎng)站[17](TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別輸入當歸補血湯所含中藥(當歸、黃芪)，獲得中藥成分、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)以及作用靶點信息，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 作為篩選標準，獲得有效成分。

1.2 有效成分作用靶點的獲得

在TCMSP 網(wǎng)站中獲得藥物有效成分的作用靶點，通過Uniprot (https://www.uniprot.org/)平臺校正其名稱，利用SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 數(shù)據(jù)庫[18]進行有效成分作用靶點的補充完善。

1.3 RIHD疾病靶點的獲得

在 Therapeutic Target Database[19](TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)，Drugbank(https://www.drugbank.ca/)等網(wǎng)站共同檢索RIHD相關(guān)靶點信息并進行整合。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選后的有效成分所對應(yīng)的靶點與疾病相關(guān)靶點進行匹配，共同靶點在STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中建立蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape3.2.1[20](http://www.cytoscape.org/)軟件進行當歸活血湯主要有效成分、靶點、通路之間的網(wǎng)絡(luò)分析。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路分析

采用 Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery v6.8 數(shù) 據(jù) 庫[21](DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)對 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)進行GO生物學功能富集分析和KEGG[22]通路富集分析。

1.6 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的當歸補血湯成分與與其相關(guān)聯(lián)的重要交集蛋白及KEGG 富集出生物通路的相互作用信息，上傳到Cytoscape 3.2.1 軟件中，利用Merge功能構(gòu)建出成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 當歸補血湯有效成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 的標準進行篩選后共得到 22個有效成分(表 1)。當歸2個，包括β-谷固醇、豆甾醇；黃芪20個，包括黃芪甲苷、異鼠李素和菲-3-酚等。

2.2 在Cytoscape 3.2.1軟件中導入當歸補血湯的活性成分預(yù)測其作用靶標，構(gòu)建活性成分-心肌損傷靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

如圖1所示，此網(wǎng)絡(luò)共包括114個節(jié)點，183個邊。不同的節(jié)點代表當歸補血湯潛在的活性成分與作用靶點。當歸補血湯中共篩選出22個化合物，其中hederagenin、isorhamnetin及isoflavanon等 5個成分在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未檢索到相應(yīng)作用靶點，所以在成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中未顯示。自由度是反映節(jié)點重要性的指標，成分節(jié)點的度越大，表示該成分參與的生物功能越多，生物學重要性越強。對圖1 分析可得出當歸補血湯的重要核心成分包括β-谷固醇(betasitosterol，MOL000358)、豆 甾 醇(Stigmasterol，MOL000449)、黃芪甲苷 (formononetin，MOL000392)等。發(fā)揮作用的重要靶點以3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR)、前列腺素 G/H 合成酶 1、2(Prostaglandin G/H synthase 1、2)為主，PTGS1、PTGS2可能是其發(fā)揮藥效的關(guān)鍵靶點。

圖1 當歸補血湯主要活性成分——靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 放射后心肌損傷 PPI 網(wǎng)絡(luò)

在CTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫中輸入RIHD名稱，找出相關(guān)的蛋白193個，經(jīng)篩選得出98個與當歸補血湯成分作用靶點相交集蛋白。將相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導入 Cytoscape 3.2.1 軟件，得到蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖2中包括98節(jié)點，457條邊，圖中自由度值越大則節(jié)點顏色越深，結(jié)果提示當歸補血湯治療RIHD的靶標中自由度值排名前5的靶蛋白為原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src SRC)、前列腺素 G/H 合成酶2(PTGS2)、血清載脂蛋白百度A1(ApoA1)、白介素1β(IL1b)、雌激素受體α蛋白由基因(ESR1)。

圖2 放射性心肌損傷 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO生物過程和KEGG代謝通路富集分析

2.4.1 GO富集分析

通過運用 DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)平臺，根據(jù)P值標準，將104個GO生物過程進行排列，發(fā)現(xiàn)當歸補血湯治療RIHD的作用靶點涉及不同類型的生物學過程。主要涉及蛋白氧化、細胞增殖的正向調(diào)節(jié)、水解酶活性的負調(diào)控、脂質(zhì)分解代謝過程的正向調(diào)節(jié)、甘油三脂、膽固醇體內(nèi)平衡、炎癥反應(yīng)、脂蛋白代謝過程、反向膽固醇運輸、高密度脂蛋白粒子重構(gòu)、磷脂酰膽堿代謝、信號轉(zhuǎn)導等。

2.4.2 KEGG 通路富集分析

通過運用 DAVID 對當歸補血湯作用靶點及RIHD交集靶點進行富集分析，設(shè)定P＜0.01，共獲得相關(guān)通路37條，主要涉及PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、花生四烯酸代謝通路、癌癥的中心碳代謝通路、雌激素信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、cAMP信號通路、血小板活化通路、cGMP-PKG信號通路等。

2.5 有效成分-靶點-信號通路構(gòu)建

利用 Cytoscape 3.2.1 軟件中的 Merge 功能構(gòu)建活性成分-作用靶點-代謝通路網(wǎng)絡(luò)，如圖3。

圖3 GO 富集分析結(jié)果-log10(P-Value)

圖4中包括當歸補血湯核心成分 7 種，用三角形表示，RIHD重要靶點42個，用圓形表示；信號通路10條，用菱形表示。成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)顯示，所預(yù)測出當歸補血湯治療RIHD 7 種潛在的活性成分與ESR1、SRC、ApoA1、IL1β及 PTGS2 等 42 個 靶蛋密切相關(guān)，通過PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、花生四烯酸代謝通路、雌激素信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、cAMP信號通路、血小板活化通路、cGMP-PKG信號通路等多條信號通路參與調(diào)控RIHD發(fā)病過程的不同環(huán)節(jié)。

圖4 當歸補血湯主要活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學理論初步篩選出當歸補血湯治療RIHD的有效成分包括β-谷固醇、豆甾醇、黃芪甲苷(formononetin，MOL000392)等 17種化合物，提示黃芪甲苷、豆甾醇是當歸補血湯發(fā)揮作用的主要成分。研究表明，黃芪甲苷通過影響心肌細胞肥大，抑制心肌細胞纖維化和細胞凋亡來改善心肌重塑，保護心肌[23]。實驗證實黃芪甲苷能降低高脂大鼠心肌缺血再灌注的損傷，其作用機制可能與黃芪甲苷及人參皂苷 Rg1降低炎癥反應(yīng)、抑制PINK1-Parkin介導的線粒體過度自噬相關(guān)[24]。豆甾醇是心血管疾病的獨立有效危險因素，其蓄積會導致左心室功能障礙，心臟間質(zhì)纖維化和巨噬細胞浸潤而不引起動脈粥樣硬化，并增加死亡率[25]。

基于PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)分析藥物-疾病交集靶蛋白得到5個重要關(guān)鍵靶點為原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)、前列腺素 G/H 合成酶2(PTGS2)、血清載脂蛋白A1(ApoA1)、白介素1β(IL1β)、雌激素受體α蛋白由基因(ESR1)，由此說明本方的核心成分可通過以上5個核心靶點發(fā)揮抗RIHD的作用。所預(yù)測出當歸補血湯治療RIHD中17種潛在的活性成分與IL1β、ApoA1、ESR1 及前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶(PTGS1，PTGS2)等5種蛋白存在較強的相互作用。

通過對藥物-疾病-靶點富集分析發(fā)現(xiàn)，當歸補血湯的作用涉及多個生物學過程，主要有蛋白氧化、細胞增殖的正向調(diào)節(jié)、水解酶活性的負調(diào)控、脂質(zhì)分解代謝過程的正向調(diào)節(jié)、甘油三脂、膽固醇體內(nèi)平衡、炎癥反應(yīng)、脂蛋白代謝過程、反向膽固醇運輸、高密度脂蛋白粒子重構(gòu)、磷脂酰膽堿代謝、信號轉(zhuǎn)導等生物過程。通過分析富集的 KEGG 通路可以發(fā)現(xiàn)，靶點基因主要集中在PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、花生四烯酸代謝通路、雌激素信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、cAMP信號通路、血小板活化通路、cGMP-PKG信號通路等多條信號通路。研究表明，PI3K/AKT信號通路與細胞生長、炎性反應(yīng)以及細胞凋亡有著重要聯(lián)系。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，參與細胞的能量代謝、增殖、分化以及凋亡[26]；有文獻指出，缺血后處理保護心肌其機制可能是通過再灌注損傷補救酶(RISK)途徑中細胞內(nèi)生存途徑磷酸肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)途徑的激活(磷酸化)抑制凋亡的線粒體途徑[27]。由此可見，當歸補血湯中有效成分通過作用于多個靶點、調(diào)控多條信號通路，從而達到治療RIHD的作用。祖國醫(yī)學認為正氣不足是疾病發(fā)生的重要原因之一，正所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”，正氣不足可導致機體免疫功能低下，從而使“外邪”易于侵襲機體，病情遷延，難以痊愈，增強正氣、提高機體免疫功能是祖國醫(yī)學治療疾病的優(yōu)勢之一。而當歸補血湯具有扶正驅(qū)邪，補益氣血，減毒增效之功，能有效延長能患者生存時間、減少放化療不良反應(yīng)并且提高機體免疫力，從而達到治療RIHD的目的。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法從分子層面預(yù)測當歸補血湯的豆甾醇、黃芪甲苷等2個成分主要通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路共同參與機體氧化、細胞增殖的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、脂蛋白代謝過程、磷脂酰膽堿代謝、信號轉(zhuǎn)導等過程，協(xié)同治療RIHD，證實了中藥復方是通過多靶點、多層面聯(lián)合調(diào)控疾病的發(fā)生過程。本研究雖然為當歸補血湯治療RIHD提供了科學的理論支持，為復雜的中藥體系提供了研究思路，但仍存在明顯不足之處，缺乏需要臨床觀察研究和藥理實驗的后期驗證。

表2 37條KEGG相關(guān)通路