■鄒孟琳 高麒笙 薛夢涵 程 娜 付 彪 夏 險， 胡遠(yuǎn)亮，*

（1.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北黃石435002；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢430070)

丁酸梭菌是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢的專性厭氧桿菌，廣泛存在于奶酪、腸道和土壤等環(huán)境中[1-2]，是人和動物腸道內(nèi)的正常菌群，能夠抑制腸道中某些有害微生物的生長，同時產(chǎn)生益生物質(zhì)，在增強機體免疫力和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮作用[3-5]。丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)物以丁酸和乳酸為主，也可以產(chǎn)生淀粉酶、糖苷酶、蛋白酶、酯酶、纖維素酶和半纖維素酶等多種酶類，能夠提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和抗氧化能力，改善腸道屏障功能[6-7]。可應(yīng)用在食品、工業(yè)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域[8]。

我國對丁酸梭菌的研究起步較晚。目前，國內(nèi)丁酸梭菌制劑產(chǎn)量不足、價格昂貴、活菌數(shù)低、保質(zhì)期短，難以滿足市場對丁酸梭菌的需求。這些問題主要是由于丁酸梭菌培養(yǎng)難度大、高密度培養(yǎng)技術(shù)不成熟和發(fā)酵設(shè)備不先進等原因造成[9-10]。因此，丁酸梭菌規(guī)?；a(chǎn)發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)化在應(yīng)用市場上擁有較好的研究前景。

丁酸梭菌活菌在最終得到的商品化菌劑中大都以芽孢的形式存在[11]，已有研究表明優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件可以直接影響菌體的繁殖[12-13]。本研究采用單因素試驗和正交試驗在搖瓶中對丁酸梭菌培養(yǎng)基的碳源、氮源以及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并通過5 L發(fā)酵罐進一步優(yōu)化接種量、溫度等培養(yǎng)條件，以提高單位體積的丁酸梭菌芽孢數(shù)量，為丁酸梭菌制劑產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

丁酸梭菌（Clostridium butyricum)M1來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

丁酸梭菌增殖半固體培養(yǎng)基：酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、NaCl 5 g、CH3COONa·3H2O 3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、0.5%美藍(lán)0.2 mL、瓊脂6 g，加蒸餾水溶解至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至(7.1±0.1)，115℃滅菌20 min，備用。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(W/V)：葡萄糖(2%)、酵母浸粉(4.5%)、胰蛋白胨(1.5%)、大豆蛋白胨(1.3%)、(NH4)2SO4(0.1%)、NaHCO3(0.124%)、玉米漿粉(0.7%)、MnSO4·H2O(0.05%)、MgSO4·7H2O(0.05%)、CaCl2(0.1%)，初始pH為7.5。

1.3 碳氮源優(yōu)化

碳源優(yōu)化。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別以1%（W/V）添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖等小分子糖為碳源，其他成分保持不變。培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，上覆2 cm液體石蠟，以1%接種丁酸梭菌培養(yǎng)液，每組3個重復(fù)。37℃培養(yǎng)24 h，測定OD650，確定最佳碳源。培養(yǎng)基其他成分保持不變，最佳碳源的添加量分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%和5%，接種量和培養(yǎng)條件如1.3所述，檢測OD650，優(yōu)化碳源添加量。

氮源優(yōu)化。以優(yōu)化的碳源培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以1%（W/V）添加牛肉浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨為有機氮源，接種量和培養(yǎng)條件如1.3所述，測定OD650，優(yōu)化有機氮源。此外，分別以1%（W/V）添加尿素、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨為無機氮源。接種量和培養(yǎng)條件如1.3所述，測定OD650，優(yōu)化無機氮源。

有機氮源添加量優(yōu)化。根據(jù)上述單因素試驗氮源優(yōu)化的結(jié)果，選取對丁酸梭菌生長影響最顯著的3種有機氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨和牛肉浸粉），分別設(shè)置為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%（W/V）添加至培養(yǎng)基中（其他成分保持不變），接種量和培養(yǎng)條件如1.3所述，測定OD650，優(yōu)化氮源添加量。

根據(jù)試驗結(jié)果，設(shè)計3因素3水平的正交試驗配制不同培養(yǎng)基（表1），其他成分保持不變，接種量和培養(yǎng)條件如1.3所述，檢測OD650，優(yōu)化復(fù)合有機氮源添加量。

表1 正交試驗設(shè)計

1.4 接種量和溫度優(yōu)化

接種量。種子液分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量添加到優(yōu)化的滅菌培養(yǎng)基中，每組3個重復(fù)，在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h取樣，檢測OD650，比較不同接種量得到的最終菌體生物量，優(yōu)化接種量。

溫度。以接種量1%添加到優(yōu)化的滅菌培養(yǎng)基中，分別于34、37、40、43℃恒溫培養(yǎng)，每組3個重復(fù)，對應(yīng)溫度下培養(yǎng)24 h取樣，檢測OD650，優(yōu)化培養(yǎng)溫度。

1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝研究

厭氧培養(yǎng)方式。在5 L自控發(fā)酵罐中裝入優(yōu)化的培養(yǎng)基，裝液系數(shù)75%。將培養(yǎng)好的三角瓶一級種子培養(yǎng)基接入滅菌后冷卻的發(fā)酵罐中（37℃左右），接種量3%，控溫37℃培養(yǎng)。分別采取在發(fā)酵罐上層覆蓋2 cm的石蠟油或連續(xù)通入氮氣以維持厭氧或低氧狀態(tài)。培養(yǎng)30 h，每隔2 h取樣鏡檢，觀察芽孢形成情況，若芽孢形成率在90%以上，終止發(fā)酵。并進行芽孢計數(shù)，確定最佳厭氧培養(yǎng)方式。

控制pH。在發(fā)酵罐上層覆蓋2 cm的石蠟油，接種方式、接種量和培養(yǎng)溫度如1.5所述。采取自然pH發(fā)酵，或補堿分別控制pH在6.0、6.5、7.0、7.5條件下培養(yǎng)，發(fā)酵過程及采樣方式如1.5所述。發(fā)酵結(jié)束進行芽孢計數(shù)，分析控制不同pH條件下的發(fā)酵效果，確定最佳pH。

中和劑。石蠟油密封，接種方式、接種量和培養(yǎng)溫度如1.5所述。分別采用1 mol/L的氫氧化鈉（NaOH）、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸氫鈉（NaHCO3）和氨水（NH3·H2O）溶液流加以控制最適pH 6.5。發(fā)酵過程及采樣方式如1.5所述，發(fā)酵結(jié)束進行芽孢計數(shù)，確定最佳中和劑。

流加補料。采用碳酸氫鈉（1 mol/L）流加控制最適pH 6.5，培養(yǎng)12 h，流加3%葡萄糖（W/V），以未補料發(fā)酵組作為對照，其他條件如1.5所述。發(fā)酵結(jié)束進行芽孢計數(shù)，分析補料對丁酸梭菌葡萄糖代謝與生長曲線的影響。

1.6 芽孢計數(shù)方法

取18 mm×180 mm的試管，裝入梭菌增殖半固體培養(yǎng)基（0.6%）15 mL，調(diào)節(jié)pH至7.1±0.1，115℃，20 min滅菌，其上覆蓋約2～3 mL無菌石蠟油密封。使用前將半固體培養(yǎng)基沸水浴30 min去除氧分，冷卻至50℃左右接種。取混合均勻的發(fā)酵液2～3 mL，65℃水浴10 min，殺死營養(yǎng)體，準(zhǔn)確吸取1 mL，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋至適宜濃度，選擇連續(xù)3個濃度梯度，各取200μL添加至試管培養(yǎng)基中，輕輕振蕩均勻，每個梯度3個重復(fù)組，37℃培養(yǎng)16 h，肉眼觀察計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計分析

碳氮源、正交試驗、接種量和溫度優(yōu)化，每組3個搖瓶重復(fù)。發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝優(yōu)化，每次采樣3次，求平均值。運用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，誤差線用SD表示，各組之間的差異采用Tukey’s HSD檢驗，以P＜0.05為顯著差異，統(tǒng)計數(shù)據(jù)可視化采用Excel 2019處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源優(yōu)化（見圖1）

圖1 不同碳源（A）和葡萄糖濃度（B）對丁酸梭菌生長的影響

從圖1A可以看出，該菌株可利用的最佳碳源為葡萄糖。微生物在生長過程中，需要一定量的碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)，碳源含量過低微生物缺少營養(yǎng)，導(dǎo)致其生長受到限制；過高促使培養(yǎng)基滲透壓升高，導(dǎo)致微生物細(xì)胞內(nèi)部水分不足，生長受阻甚至死亡。確定最佳碳源為葡萄糖，進一步優(yōu)化其添加量，結(jié)果表明最適添加量為3%（圖1B）。

2.2 氮源優(yōu)化（見圖2）

從圖2A可以看出，在有機氮源中，該菌株對酵母浸粉、胰蛋白胨和牛肉浸粉的利用效果最好；在無機氮源中，該菌株對硫酸銨的利用效果最好?？紤]到遲效、速效氮源相結(jié)合能達(dá)到更好的效果[14]，因此選擇酵母浸粉、胰蛋白胨和牛肉浸粉，分別與硫酸銨（0.1%）作為復(fù)合氮源。結(jié)果表明，酵母浸粉、胰蛋白胨和牛肉浸粉的最適添加量分別為2.5%、3.0%和3.0%（圖2B～圖2D）。

圖2 不同氮源對丁酸梭菌生長的影響

根據(jù)單因素氮源試驗，酵母浸粉、胰蛋白胨和牛肉浸粉對丁酸梭菌的生長影響最為顯著。以這3個因素設(shè)計正交試驗研究復(fù)合氮源對丁酸梭菌M1生長的影響，確定最佳的氮源組合。綜合表2和表3的極差、方差分析可知，極差順序為：RA＞RB＞RC，方差檢驗顯著性為A＞B＞C。由此得出這3個因素對該菌株生長影響大小依次為：酵母浸粉＞胰蛋白胨＞牛肉浸粉，各因素方差P均大于0.05，證明該水平試驗中3個因素均對結(jié)果不顯著（P＞0.05）。由此確定正交試驗的理論最優(yōu)組合為A2B2C3，該組合正好在9組試驗中，最佳有機碳源組合為：酵母浸粉1.5%，胰蛋白胨2%，牛肉浸粉2.0%和3.0%。

表2 正交試驗結(jié)果

綜上對碳氮源優(yōu)化試驗結(jié)果進行統(tǒng)計，得出優(yōu)化培養(yǎng)基為：葡萄糖3%，酵母浸粉1.5%，胰蛋白胨2.0%，牛肉浸粉3.0%，(NH4)2SO40.1%，NaHCO30.124%，玉米漿粉0.7%，MnSO4·H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.1%，初始pH 7.5。

2.3 接種量和溫度優(yōu)化（見圖3）

圖3 不同接種量（A）和溫度（B）對丁酸梭菌生長的影響

從圖3可以看出，優(yōu)化后培養(yǎng)基最適接種量3%，最適培養(yǎng)溫度37℃。

2.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝研究

厭氧培養(yǎng)方式對丁酸梭菌生長的影響結(jié)果表明，添加石蠟油菌體生長更好，結(jié)束時發(fā)酵液芽孢數(shù)為3.1×108CFU/mL（圖4A）；控制pH發(fā)酵影響丁酸梭菌生長，補堿控制pH發(fā)酵條件下的芽孢數(shù)明顯高于自然pH條件下發(fā)酵。丁酸梭菌在生長代謝過程中產(chǎn)生丁酸、乙酸等酸性物質(zhì)，這些物質(zhì)使得培養(yǎng)基的pH迅速降低，抑制了丁酸梭菌的生長[15]，補堿控制pH能解除這種抑制，促進丁酸梭菌生長，符合王勇等[16]研究出的人為補堿可以提高丁酸梭狀芽孢桿菌作用發(fā)酵能力的結(jié)論。其中，將pH控制在6.5時丁酸梭菌發(fā)酵效果最好，最終發(fā)酵液芽孢數(shù)為3.8×108CFU/mL（圖4B）；中和劑對丁酸梭菌生長的影響表明，以NaHCO3為中和劑將pH控制在6.5時發(fā)酵效果最好，最終發(fā)酵液芽孢數(shù)為4.6×108CFU/mL（圖4C）。

圖4 厭氧培養(yǎng)方式（A）、pH控制（B）和中和劑（C）對丁酸梭菌芽孢數(shù)的影響

丁酸梭菌發(fā)酵罐培養(yǎng)檢測表明，發(fā)酵液中葡萄糖的含量在4 h起迅速下降，在12 h含量幾乎為0，丁酸梭菌芽孢數(shù)量在20 h達(dá)到穩(wěn)定期，維持在6.0×108CFU/mL左右（圖5A）。這說明從12 h開始，發(fā)酵液中葡萄糖含量不能滿足丁酸梭菌快速生長的需要。因此，設(shè)計在第12 h流加3%的葡萄糖溶液（W/V）進行補料發(fā)酵，并繪制葡萄糖含量與芽孢數(shù)量變化曲線（圖5B）?？梢钥闯觯∷崴缶L穩(wěn)定期延遲，芽孢數(shù)量提高，培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液的丁酸梭菌芽孢數(shù)量提高至1.19×109CFU/mL，培養(yǎng)36 h達(dá)1.32×109CFU/mL。

圖5 補料對丁酸梭菌葡萄糖代謝與生長曲線的影響

3 討論

2006年，歐盟全面禁止在飼料中添加抗生素。緊隨其后，許多國家制定了相關(guān)的畜產(chǎn)品藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)，限制或禁止在動物飼料中添加抗生素[17]，2009年7月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)了丁酸梭菌為新飼料添加劑[18]。目前，不少研究證實微生物飼料添加劑代替飼用抗生素能夠取得較好的效果[19-20]。丁酸梭菌作為新飼料添加劑，具有較強的抗生素耐受性，與抗生素聯(lián)用時受影響較小[21]，在抑制動物腹瀉、增強動物免疫能力等方面展現(xiàn)出積極作用[22-23]。此外，丁酸梭菌在治療骨質(zhì)疏松、肥胖癥和高尿酸血癥等人體健康方面取得了較好的成效[24-26]。

丁酸梭菌生產(chǎn)有厭氧液態(tài)發(fā)酵、厭氧固態(tài)發(fā)酵和厭氧混菌發(fā)酵3種主要方式[27]。通常，工業(yè)上生產(chǎn)采用的液態(tài)培養(yǎng)基中，添加了大豆餅粉等緩沖能力較強的營養(yǎng)物質(zhì)，而清液發(fā)酵培養(yǎng)基不宜采用大豆餅粉，因此緩沖能力較差。但清液發(fā)酵后期菌體收集更加簡便，生產(chǎn)成本更為低廉[28]。本研究中，采用單因素試驗對丁酸梭菌初始培養(yǎng)基的碳氮源進行篩選和濃度優(yōu)化，結(jié)果表明最佳碳源為葡萄糖，有機氮源為酵母浸粉，無機氮源為硫酸銨。最佳碳源與戚薇等[29]優(yōu)化碳源結(jié)果基本一致，與劉磊等[9]研究結(jié)果最佳碳源為葡萄糖、有機氮源為蛋白胨、無機氮源為硫酸銨的結(jié)果大致相符合。

丁酸梭菌發(fā)酵過程中有機酸的產(chǎn)生與積累是引起發(fā)酵液pH值下降的主要原因。根據(jù)丁酸梭菌發(fā)酵液pH變化曲線和菌體生長曲線特性顯示，菌體生長速度和pH值變化密切相關(guān)。為了維持菌體生長速度，后續(xù)采用碳酸氫鈉作為中和劑，結(jié)果顯示控制pH 6.5，丁酸梭菌生長最佳；樊曉璐等[30]發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌在pH值6～7范圍內(nèi)生長良好，而邱權(quán)等[11]研究則表明丁酸梭菌在中性或偏堿的環(huán)境中生長更好，其結(jié)果的差異可能與丁酸梭菌菌株特性及培養(yǎng)方式有關(guān)。丁酸梭菌發(fā)酵過程中存在碳溢流代謝現(xiàn)象并會出現(xiàn)碳源供應(yīng)不足的問題[31]。本試驗中優(yōu)化后培養(yǎng)基在發(fā)酵12 h后葡萄糖含量幾乎為0，在流加控制pH的基礎(chǔ)上，第12 h流加補料3%葡萄糖，可使丁酸梭菌發(fā)酵穩(wěn)定期延遲。

通常情況下，丁酸梭菌的發(fā)酵水平在數(shù)量級109以下，個別生產(chǎn)廠商經(jīng)過噴霧干燥工藝制得的粉狀產(chǎn)品有效活菌數(shù)可達(dá)1×1010CFU/g。本研究在單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源基礎(chǔ)上，通過正交試驗進一步優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源組合。發(fā)酵罐優(yōu)化過程中，采用碳酸氫鈉溶液流加控制pH和葡萄糖補料的方式，解決了發(fā)酵過程中pH不穩(wěn)定和碳溢流代謝等問題，最終使得優(yōu)化的丁酸梭菌發(fā)酵液的芽孢數(shù)量大幅提高，培養(yǎng)36 h，芽孢數(shù)量達(dá)1.32×109CFU/mL。

4 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：葡萄糖3%、酵母浸粉1.5%、胰蛋白胨2.0%、牛肉浸粉3.0%、(NH4)2SO40.1%、NaHCO30.124%、玉米漿粉0.7%、MnSO4·H2O 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.1%，初始pH 7.5，培養(yǎng)溫度37℃，接種量3%。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，采用碳酸氫鈉控制pH 6.5，第12 h流加補料3%的葡萄糖，發(fā)酵液芽孢含量大幅度提高。本研究為丁酸梭菌實驗室培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。