關 晶＊，童 欣＊，張 怡，徐 凡，張譽馨，梁秀睿，金佳琦，敬泓滟，郭柳纖，倪欣睿，傅繼華

（1.中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院生理學系，江蘇 南京 210009；2.中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指腎功能在較短時間內下降，導致血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，CRE）濃度增加以及出現蛋白尿［1］。除急性期的腎功能障礙外，AKI還存在持續(xù)組織損傷的顯著風險，導致腎小球濾過率持續(xù)下降，腎功能無法恢復，進而發(fā)展成慢性腎?。?］。腎作為各種化學藥物毒性作用的主要器官，臨床上經常發(fā)生AKI。順鉑在腎近端小管細胞中積累，臨床上約1/3患者出現AKI［3］。研究發(fā)現，AKI的發(fā)生主要是因順鉑使腎細胞出現氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥和細胞凋亡［4-5］；使線粒體呼吸鏈受損，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多［5］。順鉑導致細胞損傷的機制尚未闡明。

有研究報道，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）參與腎的病理狀態(tài)。腎近端小管細胞可高水平表達芳香族L-氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）［6］。該酶可將 5-羥色氨酸脫羧變成5-HT，生理條件下通過旁分泌調節(jié)腎中磷酸鹽排泄。5-HT的合成正是在色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，Tph；外 周 為 Tph1）、AADC的2步催化下完成［7］。研究表明，5-HT高水平合成可導致慢性腎病并發(fā)尿毒癥［8］，還參與糖尿病腎病的發(fā)生。在人系膜細胞，5-HT作用于5-HT2A受體（5-HT2Areceptors，5-HT2AR）后產生大量ROS［9］，通過調節(jié)下游細胞因子的表達，引起組織炎癥、損傷和壞死［10］。5-HT2AR拮抗劑鹽酸沙格雷酯（sarpogrelate hydrochloride，SH）對糖尿病腎病小鼠的血糖、腎功能、腎組織損傷均有明顯改善作用［11］；SH可顯著延緩糖尿病腎病的發(fā)展［12］。腎細胞中還存在單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO-A），參與內源性和外源性胺的脫氨基作用［13］和腎中ROS的產生［14-15］。我們前期研究發(fā)現，外周5-HT系統(tǒng)與胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝、血脂紊亂、炎癥反應及糖尿病性疲勞等慢性代謝性疾病密切相關［16-18］。本研究采用順鉑誘導的AKI小鼠模型，研究5-HT2AR拮抗劑SH及5-HT合成抑制劑卡比多巴（cardidopa,CDP）對順鉑引起的腎組織氧化應激、炎癥和細胞凋亡的影響，評估SH和CDP對順鉑致腎毒性的預防作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

順鉑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），SH（上海乾勁化工科技有限公司），CDP（浙江手心制藥有限公司）。CRE、BUN、白蛋白（albumin，Alb）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；BCA試劑和Hoechst染料（上海碧云天生物技術研究所）；ROS、5-HT、多巴胺（dopa?mine，DA）、白細胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；小鼠抗小鼠MAO-A單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology）；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9多克隆抗體（沈陽萬類生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗體（Biosharp生物科技有限公司）。TGL-16gR高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；Bio-Rad Mini-Protean?Tetra System蛋白電泳設備和Bio-Rad Mini Trans-Blot轉印槽（新加坡Bio-Rad公司）；Infinite M200 Pro全波長酶標儀（瑞士Tecan公司）；IX51型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Tanon 5200 Multi全自動化學發(fā)光系統(tǒng)（上海天能有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.2 AKI模型制備和分組

72只雄性6～8周齡清潔級ICR小鼠（揚州大學動物醫(yī)學比較中心），體重22～25 g，許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。小鼠正常飼養(yǎng)管理，環(huán)境溫度24～26℃，濕度50%～55%，光照12 h，黑暗12 h。

依據本實驗室前期研究，聯合給藥時SH∶CDP=2∶1療效最佳；該SH和CDP比例接近等摩爾劑量（SH和CDP相對分子質量分別為465和226）、療效有協(xié)同效應［16，18］。小鼠適應性飼養(yǎng) 1 周后，按體重均衡的原則隨機分為6組，每組12只：正常對照組、模型組、模型+SH 50 mg·kg-1組、模型+CDP 25 mg·kg-1組、模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組、模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組。各給藥組首先預防性ig給藥7 d，每天2次（間隔12 h給藥1次），正常對照組和模型組給予等體積溶劑（0.5%CMC-Na溶液），7 d后除正常對照組外，其余小鼠ip給予順鉑25 mg·kg-1誘導AKI，繼續(xù)給藥3 d，于造模后72 h將小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后處死，收集血液和腎組織。1800×g離心10 min收集血清，腎組織用4%甲醛固定或-80℃保存待測。實驗數據統(tǒng)計時，剔除死亡小鼠（模型組2只，CDP 25 mg·kg-1組1只）和未表現AKI的小鼠（特征是腎外觀顏色與模型組相比無改變，且血清CRE和BUN升高不明顯；除模型組外每組出現1～2只）。

1.3 酶標法檢測小鼠血清BUN、CRE和Alb含量及腎組織MDA含量和SOD活性

取1.2分組制備的血清和腎組織，肌氨酸氧化酶法測定血清CRE含量，脲酶法測定血清BUN含量，溴甲酚綠法測定血清Alb含量，硫代巴比妥酸法測定腎組織MDA含量和羥胺法測腎組織SOD活性。

1.4 ELISA檢測腎組織中ROS，5-HT，DA，TNF- α和IL-1 β水平

從-80℃冰箱內取出1.2制備的腎組織標本，在冰上用小剪刀剪取腎組織，按腎組織：生理鹽水=1∶9（V/V）的比例制備10%腎組織勻漿。按試劑盒說明書，ELISA測定小鼠腎組織勻漿中ROS，5-HT，DA，TNF-α和IL-1β水平。

1.5 HE染色觀察腎組織病理損傷

取1.2分組制備的腎組織，按常規(guī)方法進行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。切成3 μm厚切片，經脫蠟、梯度乙醇和HE染色，中性樹膠封片。通過IX51型熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.6 Hoechest33342熒光染色檢測小鼠腎組織細胞凋亡

取1.2分組制備的腎組織，固定后石蠟包埋，以3 μm切片。激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm）DAPI通道（藍色熒光）觀察并拍照。

1.7 Western印跡法檢測小鼠腎組織中MAO-A、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9蛋白表達水平

取1.2分組制備的腎組織，腎組織RIPA裂解后離心，取上清液；BCA法測蛋白濃度，上樣緩沖液后進行SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜；BSA封閉后加入對應的一抗（Tph1，1∶1000；AADC，1∶700；5-HT2AR，1∶500；MAO-A，1∶500；活化胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶 9、Bcl-2和Bax，1∶500），于4℃孵育過夜，TBST清洗；加入山羊抗兔IgG抗體（1∶40 000）和山羊抗小鼠IgG抗體（1∶100 000），室溫孵育后，采用Tanon 5200 Multi全自動化學發(fā)光系統(tǒng)觀察并拍照。Image J軟件分析條帶積分吸光度值，目的蛋白積分吸光度值與內參GAPDH積分吸光度值比表示待測蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 SH和CDP聯用對順鉑誘導小鼠急性腎損傷血清CRE、BUN和Alb含量及腎組織MDA含量和SOD活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清CRE和BUN及腎組織MDA含量顯著升高（P＜0.01），血清Alb含量和腎組織SOD活性則明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組血清CRE、BUN及腎組織MDA 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），腎組織SOD活性顯著升高（P＜0.01）；血清Alb除模型+CDP 25 mg·kg-1組無顯著升高外，其余各組均顯著升高（P＜0.01）。與模型+SH 50 mg·kg-1相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1聯合用藥組血清CRE和BUN濃度及腎組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），血清 Alb濃度和腎組織SOD活性均顯著升高（P＜0.01）。與模型+CDP 25 mg·kg-1組相比，2個聯合用藥組血清CRE和BUN濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），血清Alb濃度和腎組織SOD活力均顯著升高（P＜0.01），模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎組織MDA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1聯合用藥組血清CRE和BUN濃度及腎組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），腎組織SOD活力均顯著升高（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of preventive treatment with sargrelate hydrochloride（SH）and cabidopa（CDP）（alone or in combina?tion）on levels of serum creatinine（CRE），blood urea nitrogen（BUN），albumin（Alb）in serum，and malondialde?hyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity in renal tissues in cisplatin（CDDP）-induced acute kidney injury(AKI)mice

2.2 SH和CDP聯用對順鉑誘導急性腎損傷小鼠腎組織5-HT，DA，ROS，TNF- α和IL-1 β的影響

ELISA檢測結果（表2）顯示，與正常對照組相比，模型組腎組織5-HT，ROS，TNF-α和IL-1β含量顯著升高（P＜0.01），而DA無明顯變化。與模型組比較，各給藥組DA含量無明顯變化，且除模型+CDP 25 mg·kg-1組TNF-α和IL-1β含量無明顯降低外，其余給藥組TNF-α、IL-1β及各給藥組5-HT和ROS含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型+SH 50 mg·kg-1組相比，2個聯合用藥組腎組織5-HT和TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎組織ROS和IL-1β含量顯著降低（P＜0.01）。與模型+CDP 25 mg·kg-1組相比，2個聯合用藥組腎組織5-HT，ROS，TNF-α和IL-1β含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。且與模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎組織5-HT（P＜0.05）、ROS、TNF-α和IL-1β均顯著降低（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on levels of renal 5-hydroxy?tryptamine(5-HT)，dopamine(DA),reactive oxygen speies(ROS)，tumor necrosis factor- α (TNF- α)and interleu?kin-1 β (IL-1 β)in CDDP-induced AKI mice

2.3 SH和CDP聯用對順鉑誘導急性腎損傷小鼠腎組織病理改變的影響

如圖1所示，模型組小鼠腎外觀顏色由正常的紫紅色變?yōu)榛野咨?個聯合用藥組腎顏色為粉紅色，尤以模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組最明顯（圖1B）。HE染色可見，模型組腎組織病變主要出現在腎小球周圍腎小管，而腎小球病變不明顯；腎小球周圍腎小管大片損傷，表現為上皮細胞大量脫落、壞死、空泡化和管形破壞。各給藥組可見腎小管病變減輕，以SH和CDP聯合用藥組療效最佳。

Fig.1 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on kidney appearance and renal pathological injury induced by CDDP in AKI mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：representative pictures of kidneys in each group；B：representative pictures of renal tissue sections by hematoxylin and eosin（HE）staining.Typically，the arrows show renal tubules epithelial cells shedding，necrosis or vacuolization in the model.

2.4 SH和CDP聯用對順鉑誘導急性腎損傷小鼠腎組織細胞凋亡的影響

如圖2所示，Hoechst33342熒光染色細胞凋亡檢測表明，與正常對照組比較，模型組細胞凋亡主要出現在腎小管上皮細胞，且以腎小球周圍腎小管最明顯，可見細胞核的熒光藍染加深、腎小管上皮細胞脫落和管形破壞、幾乎不見完整管形。各給藥組均顯示細胞凋亡程度減輕，細胞核Hoechst33342熒光亮度減弱，腎小管上皮細胞的破壞減輕，其中模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎小管管形完整，上皮細胞未被破壞。

Fig.2 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on apoptosis induced by CDDP in renal tissue detected by Hoechst33342 fluorescent staining.See Tab.1 for the mouse treatment.

2.5 SH和CDP聯用對順鉑誘導急性腎損傷小鼠腎組織MAO-A、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶 3和胱天蛋白酶9蛋白表達水平的影響

Western印跡結果（圖3）所示，與正常對照組比較，模型組MAO-A、Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶 3表達水平顯著升高（P＜0.01），而Bcl-2表達水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組MAO-A表達明顯降低（P＜0.01），且與各組對腎組織ROS含量升高的抑制程度一致（表2）；除模型+CDP 25 mg·kg-1組外，其余各給藥組Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3表達明顯降低而Bcl-2表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型+SH 50 mg·kg-1組和模型+CDP 25 mg·kg-1組相比，2個聯合用藥組MAO-A、Bax、活化胱天蛋白酶3表達顯著降低，Bcl-2表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組胱天蛋白酶 9表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組MAO-A的顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on expression of renal MAO-A，Bax，Bcl-2，cleaved-caspase 3 and caspase 9 in CDDP-induced AKI mice detected by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with model+SH 26.7+CDP 13.3 group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，compared with model+CDP 25 group；◇P＜0.05，◇◇P＜0.01，compared with model+SH 26.7+CDP 13.3 group.

3 討論

本研究發(fā)現，SH和CDP均可有效改善順鉑導致的AKI，并且，SH和CDP聯用療效更為明顯。聯合給藥組的劑量只有SH或CDP單獨給藥組劑量約1/2，療效較SH組好或相當，且明顯好于CDP組。表明聯合給藥具有協(xié)同效應，且模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組效果好于模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組。

順鉑致AKI的發(fā)病機制復雜，現有研究認為順鉑引起ROS生成增加，進一步引起細胞氧化應激、炎癥和凋亡等［5，19-20］。一方面，ROS大量堆積引起體內發(fā)生氧化應激，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡。本研究發(fā)現，抑制5-HT2AR或5-HT合成后均可顯著降低腎組織ROS產生，改善順鉑引起的氧化應激，同時抑制5-HT2AR和5-HT合成（SH聯合CDP）療效最佳。同時發(fā)現，抑制5-HT2AR或（和）5-HT合成對順鉑引起MAO-A表達的改變同腎氧化應激水平的改變一致，表明腎氧化應激水平與5-HT在MAO-A作用下的降解過程存在內在聯系。另一方面，ROS作為信號轉導因子，能夠激活其下游的炎癥及凋亡信號通路［21-22］，導致炎性細胞因子TNF-α 和IL-1β產生，同時凋亡信號通路激活后導致胱天蛋白酶9和活化胱天蛋白酶3等為終末因子的細胞凋亡應答反應［23］，導致 AKI［24］。本研究發(fā)現，SH 及 CDP（單獨或聯合）預防性治療可有效抑制順鉑引起的AKI小鼠體內炎癥和凋亡。

前期研究表明，2型糖尿病進展過程中，高血糖及高濃度飽和脂肪酸誘導的骨骼肌疲勞、腎損傷，其關鍵原因是骨骼肌細胞及腎小球系膜細胞的MAO-A表達上調、5-HT降解增多，導致線粒體ROS產生增多［18-19］，其過程還牽涉到5-HT合成及5-HT2AR。其中，5-HT2AR可通過介導MAO-A及5-HT合成酶Tph1、AADC的表達來調控線粒體5-HT降解和ROS產生［16，18］。結合本研究結果推測，順鉑引起腎組織ROS產生增多、導致AKI的原因可能也是如此。具體可能由于AKI引起腎組織5-HT2AR激活和5-HT合成增加，進而引起5-HT降解增加，導致細胞內ROS生成增加。因此，用SH拮抗5-HT2AR和用CDP抑制5-HT合成時，可有效預防順鉑致AKI的發(fā)生?？傊?，通過同時抑制外周5-HT2AR及5-HT合成可有效預防AKI的發(fā)生，可為臨床治療AKI提供理論依據和新靶點。