鄭 圓，劉俊瑾，許 丁，邵云云，張 曉，常壯鵬，侯銳鋼，賈晉生

（1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，山西 太原 030000；3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬晉煤集團總醫(yī)院藥劑科，山西 晉城 048006）

阿德福韋酯是一類新型的核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，因價格低廉、耐藥率低等優(yōu)點常作為臨床治療慢性乙型肝炎的一線用藥［1-2］。然而，患者長期服用阿德福韋酯后易產(chǎn)生腎蓄積，進而損傷腎功能。臨床數(shù)據(jù)顯示，阿德福韋酯可使24%慢性乙型肝炎患者產(chǎn)生嚴重腎損傷［3］。亞太肝病學(xué)會制定的《乙型肝炎臨床實踐指南》中也建議應(yīng)用阿德福韋酯治療的患者至少應(yīng)當(dāng)每3個月檢查一次腎功能［4］。嚴重的腎毒性限制了阿德福韋酯的臨床應(yīng)用，因此，探究其毒理機制、尋找可靠的治療策略成為亟待解決的科學(xué)問題。

阿德福韋酯為前體藥物，口服吸收后在非特異性酯酶作用下迅速水解為阿德福韋而發(fā)揮藥效，顯著提高了母體藥物的生物利用度。阿德福韋不經(jīng)肝代謝，主要通過腎小球濾過和腎小管主動分泌的方式經(jīng)腎排泄清除。有學(xué)者指出，腎小管上皮細胞有機陰離子轉(zhuǎn)運體（organic anion transporters，Oat）介導(dǎo)阿德福韋從血液進入腎小管上皮細胞，隨后經(jīng)多藥耐藥轉(zhuǎn)運體（multidrug resistance transporters，Mrp）介導(dǎo)進入腎小管內(nèi)并隨尿液排泄，其腎蓄積主要與Oat對其的攝取作用增加和（或）Mrp對其的外排減少有關(guān)［5-7］。

近年來，關(guān)于中藥與西藥聯(lián)合使用發(fā)揮減毒增效作用的報道不斷增加，中藥輔助西藥成為臨床用藥的新方法。中藥黃芪具有補氣升陽、益衛(wèi)固表和利水消腫之功效［8］。黃芪甲苷作為黃芪的主要活性成分之一，具有降血糖［9］、腎保護［10］和抗病毒［11］等多種作用。研究表明，黃芪甲苷在改善順鉑引起的腎損傷及糖尿病所致腎損傷等方面已具有廣泛的應(yīng)用［12-13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可顯著改善阿德福韋引起的腎小管擴張及空泡樣變，療效顯著［14］。然而，黃芪甲苷能否影響阿德福韋的體內(nèi)處置過程，減少其腎蓄積進而改善腎損傷尚不清楚。因此，本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定大鼠血漿和腎組織中阿德福韋濃度，研究黃芪甲苷對阿德福韋毒代動力學(xué)的影響及其降低阿德福韋腎蓄積的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

阿德福韋（批號：M0710AS，純度≥99%），大連美侖生物技術(shù)有限公司；卡馬西平（批號：M0901AS，純度≥99%），大連美侖生物技術(shù)有限公司；阿德福韋酯（批號：RH161771，純度≥98%），上海凜恩科技發(fā)展有限公司；黃芪甲苷（批號：HQJG20180629，純度≥98%），南京春秋生物工程有限公司；羧甲基纖維素鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠；總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR預(yù)混試劑，北京聚合美生物科技有限公司；Oat1，Oat3，Mrp2，Mrp4和GAPDH引物，上海生工生物工程股份有限公司；生理鹽水（36.5%），石家莊四藥有限公司；甲醇（色譜純），美國Fisher公司；超純水（自制），山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院。

電子分析天平（SQP型QUINTIX224-1CN），德國Sartorius公司；高速冷凍離心機（D-37520 Osterode），德國Biofuge公司；渦旋儀（Vortex-5），海門市 Kylin-bell公司；超聲儀（SB3200），上海Branson公司；真空干燥箱（DZF-6050），蘇州江東精密儀器有限公司；三重四級桿復(fù)合線性離子肼質(zhì)譜儀（Q-TRAP 5500），美國AB Sciex公司；超高效液相色譜儀（LD-30A），日本Shimadzu公司；實時熒光定量PCR儀（StepOne Plus），美國Applied Biosystem公司；電動玻璃勻漿機（DY89-Ⅱ），寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 動物

30只SPF級SD雄性大鼠，體重130～170 g，購于中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0013，合格證號：No.1103242011013993。本實驗經(jīng)過了山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查批準（批準號：2015KS001）。飼養(yǎng)條件為室溫20～25℃，濕度50%～70%，明暗交替12 h/12 h，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間自由攝食和飲水。

1.3 溶液配制

對照品溶液配制：取阿德福韋對照品適量，精密稱定，加甲醇-水（3∶7，V/V）配制成濃度為1.0 g·L-1的對照品儲備液，-20℃冰箱保存。臨用前，用甲醇-水（3∶7，V/V）梯度稀釋對照品儲備液，配制成系列濃度的工作液。取內(nèi)標（卡馬西平）對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成1.0 g·L-1的對照品儲備液，-20℃冰箱保存。臨用前，用甲醇稀釋對照品儲備液，配制成50 μg·L-1的內(nèi)標工作液。

標準曲線及質(zhì)控樣品配制：將10 μL相應(yīng)阿德福韋工作液加入到90 μL空白大鼠血漿中，配制濃度為3.91，7.81，15.63，31.25，62.50，125.00，250.00和500.00 μg·L-1的阿德福韋含藥血漿，同樣的方法配成濃度為7.81，62.50和250.00 μg·L-1的血漿質(zhì)控樣品。

1.4 毒代動力學(xué)測定

12只SD雄性大鼠隨機分為2組：阿德福韋組和黃芪甲苷干預(yù)組，每組6只。以適量1%羧甲基纖維素鈉溶液將阿德福韋酯和黃芪甲苷分別制成10 g·L-1的混懸液。大鼠禁食12 h后，2組分別ig給予阿德福韋酯（30 mg·kg-1）和阿德福韋酯+黃芪甲苷（各30 mg·kg-1）。分別于給藥后0，1，1.5，2，3，4，6，8，12和 24 h經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢取血約0.5 mL，在1522×g，4℃條件下離心10 min，分離血漿，置于-20℃冰箱冷凍備用。取血漿樣品100 μL置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標工作液10 μL，渦旋5 s，加入甲醇300 μL，渦旋震蕩3 min，在16 074×g，4℃條件下離心10 min，吸取上清液50 μL至另一1.5 mL離心管中，37℃真空干燥。殘渣用100 μL甲醇-水（3∶7，V/V）復(fù)溶，渦旋3 min，在16 074×g，4℃條件下離心10 min，吸取上清液稀釋20倍后轉(zhuǎn)移至自動進樣器樣品瓶中進行UPLC-MS/MS分析。

1.5 腎轉(zhuǎn)運實驗

18只SD雄性大鼠隨機分為3組：生理鹽水正常對照組、阿德福韋組和黃芪甲苷干預(yù)組，每組6只。用適量1%羧甲基纖維素鈉溶液將阿德福韋酯、黃芪甲苷分別制成10 g·L-1的混懸液。大鼠禁食12 h后，正常對照組和阿德福韋組ig給予生理鹽水，黃芪甲苷組ig給予黃芪甲苷30 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)35 d；第8天時，除正常對照組ig給予生理鹽水外，其余各組ig給予阿德福韋酯30 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)28 d。麻醉處死大鼠取腎組織，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。精密稱取腎組織0.2 g，加入0.5 mL生理鹽水勻漿，在16 074×g，4℃條件下離心10 min，收集上清液后，按照血漿樣品處理方法進行處理。

1.6 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：Kinetex XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫：0～1.0 min，30%B～70%B；1.0～3.3 min，70%B～50%B；3.3～3.5 min，50%B～30%B；3.5～4.2 min，30%B；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：25℃；進樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）正離子模式，優(yōu)化去簇電壓（declus?tering potential，DP）、入口電壓（entrance poten?tial，EP）、碰撞能（collision energy，CE）和碰撞室出口電壓（collision cell exit potential，CXP）參數(shù)，其他參數(shù)為：離子化電壓：+5500 V；氣簾氣：40 psi；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；溫度：500℃；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式進行定量檢測。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測大鼠腎組織中Oat1，Oat3，Mrp2和Mrp4 mRNA表達水平

按照總RNA提取試劑盒說明書，采用Trizol法提取大鼠腎組織總RNA，酶標儀測定其濃度和純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，按照PCR試劑盒操作說明進行擴增。采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15 min，95℃變性 10 s，61℃退火 31 s，72℃延伸30 s，共50個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算待測樣本mRNA表達水平?；蛞镄蛄幸姳?。

Tab.1 Gene primer sequences used in real-time PCR

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件

分別在正、負離子模式下對分析物阿德福韋進行檢測。結(jié)果表明，阿德福韋和內(nèi)標卡馬西平均對正離子模式有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，母離子與子離子的質(zhì)荷比分別為：m/z274.2→m/z162.2（阿德福韋）和m/z237.1→m/z194.1（內(nèi)標卡馬西平）（圖1），質(zhì)譜主要參數(shù)的優(yōu)化條件見表2。

Fig.1 Mass spectrometry characteristic ion diagram and chemical structure formula of adefovir（Adv）（A）and internal standard carbamazepine（B）.

Tab.2 Main mass spectrometric parameters of Adv and internal standard carbazepine

2.1.2 液相條件的優(yōu)化

分別嘗試了不同比例甲酸（0.1%～0.3%）-水和甲醇或乙腈等多種組合作為流動相。結(jié)果表明，0.1%甲酸-水和甲醇作為流動相可以使分析物阿德福韋和內(nèi)標卡馬西平有更好的分離度，并且可以有效改善色譜峰的峰型（圖2），阿德福韋和內(nèi)標卡馬西平的保留時間分別為0.79和2.46 min。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 標準曲線和線性范圍

按1.3配制標準含藥血漿，按1.4方法處理后進行UPLC-MS/MS分析。以阿德福韋與卡馬西平峰面積之比為縱坐標，阿德福韋濃度為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程為y=0.00003x+0.0006，r=0.9992，表明阿德福韋在 3.91～500.00 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。大鼠血漿中阿德福韋的最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ）可以達到3.91 μg·L-1（信噪比＞10）。

Fig.2 Typical multiple reaction monitoring（MRM）chromatograms of Adv（a）and internal standard carbamaze?pine（IS，b）in rat plasma.A：blank rat plasma sample；B：blank rat plasma sample spiked with IS（50 μg·L-1）；C：blank rat plasma sample spiked with Adv（LLOQ，3.91 μg ·L-1）and IS（50 μg ·L-1）；D：blank rat plasma sample spiked with Adv（ULOQ，500 μg·L-1）and IS（50 μg·L-1）；E：a rat plasma sample collected at 3 h after ig administration of Adv dipivoxil（30 mg·kg-1）spiked with IS（50 μg·L-1）.

2.2.2 準確度和精密度

按1.3配制7.81，62.50和250.00 μg·L-13個濃度質(zhì)控樣品，每個濃度5個平行樣，按1.4方法處理，分別在同一天和連續(xù)3 d進行UPLC-MS/MS分析。以相對誤差（relative error，RE）表示方法的準確度，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度。由表3可見，批內(nèi)和批間準確度分別為-6.40%～-0.91%和-5.25%～-3.32%，批內(nèi)和批間精密度分別為1.98%～6.80%和1.66%～7.41%，均滿足生物樣品分析的要求。

Tab.3 Accuracy and precision of Adv in rat plasma

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)

分別在6批不同來源的空白血漿中加入甲醇，進行蛋白沉淀處理，于離心后的上清液中加入阿德福韋7.81，62.50和250.00 μg·L-1的質(zhì)控溶液和內(nèi)標溶液，其余按1.4操作。另取流動相代替空白基質(zhì)同法操作。通過計算基質(zhì)存在下的峰面積與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積的比值，求算阿德福韋和內(nèi)標的基質(zhì)因子，二者的比值即為內(nèi)標歸一化的阿德福韋的基質(zhì)因子。由表4可知，阿德福韋的基質(zhì)效應(yīng)為97.3%～100.7%（RSD≤4.32%），表明此前處理方法尚無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

Tab.4 Matrix effect of Adv in rat plasma

2.2.4 穩(wěn)定性

按1.3配制7.81，62.50和250.00 μg·L-13個濃度質(zhì)控樣品，分別在4℃放置24 h、-20℃放置10 d和-80℃放置21 d后取出，按1.4處理后進行UPLC-MS/MS分析。由表5可知，3種條件下阿德福韋的測定結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，表明阿德福韋在儲存和分析過程中具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 黃芪甲苷對大鼠體內(nèi)阿德福韋毒代動力學(xué)行為的影響

基于上述建立的UPLC-MS/MS方法，進一步探究阿德福韋的血藥濃度-時間曲線（圖3）。經(jīng)DAS 2.0軟件分析后，相關(guān)毒代動力學(xué)參數(shù)見表6。結(jié)果顯示，阿德福韋的血漿藥-時曲線呈現(xiàn)單峰。與阿德福韋組相比，黃芪甲苷干預(yù)組t1/2和Tmax無統(tǒng)計學(xué)差異，2組阿德福韋均在給藥4 h達到最大血藥濃度。但黃芪甲苷干預(yù)組在給藥3，4和6 h后阿德福韋血藥濃度顯著降低，Cmax，AUC0-t和 AUC0-∞明顯減小（P＜0.01），表明黃芪甲苷可明顯降低阿德福韋在體內(nèi)的峰濃度；Vd和Cl明顯增大（P＜0.01），表明黃芪甲苷可以增加阿德福韋體內(nèi)分布，進而降低其血藥濃度，同時黃芪甲苷也可增加阿德福韋的排泄，加快其在體內(nèi)的消除。上述結(jié)果說明，黃芪甲苷可以影響大鼠體內(nèi)阿德福韋的毒代動力學(xué)行為。

Fig.3 Plasma concentration-time curves of Adv after single administration of drugs to rats.The rats of the Adv group were administrated intragastrically with Adv dipivoxil at the dose of 30 mg·kg-1and the rats of the astragaloside inter?vention（Adv+As）group were administrated intragastrically with Adv dipivoxil at the dose of 30 mg·kg-1and As at the dose of 30 mg·kg-1.Blood samples were collected from the orbital venous plexus of rats at each time point at 0，1，1.5，2，3，4，6，8，12 and 24 h after single administration，respectively.±s，n=6.

2.4 黃芪甲苷對大鼠體內(nèi)阿德福韋腎蓄積的影響

與大鼠體內(nèi)阿德福韋組相比，黃芪甲苷干預(yù)組中腎組織阿德福韋濃度為（61±4）ng·g-1，降低（26.64±3.79）%（P＜0.01），表明黃芪甲苷可以降低腎組織中阿德福韋濃度，減輕阿德福韋在腎中的蓄積。

Tab.5 Stability of Adv in rat plasma

Tab.6 Toxicokinetic parameters of Adv after single administration to rats

2.5 黃芪甲苷對阿德福韋腎轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響

與鹽水對照組相比，阿德福韋組大鼠腎組織中Oat1和Oat3mRNA表達明顯升高（P＜0.01），而Mrp2和Mrp4mRNA表達無明顯變化。黃芪甲苷干預(yù)后，大鼠腎組織中Oat3mRNA表達明顯降低（P＜0.01），Mrp4mRNA表達明顯升高（P＜0.01），而Oat1和Mrp2mRNA表達無明顯變化。表明阿德福韋可通過高表達Oat1和Oat3mRNA增加其在腎組織中的蓄積，黃芪甲苷通過降低Oat3mRNA表達和增高Mrp4mRNA表達減少阿德福韋在腎組織中的蓄積（表7）。

Tab.7 Effect of Adv on mRNA expressions of organ?ic anion transporters （Oats） and multidrug resis?tance transporters（Mrps）in rat renal tissue

3 討論

本研究應(yīng)用UPLC-MS/MS方法建立了大鼠血漿阿德福韋的定量方法，該方法操作簡單，具有較高的靈敏度和專屬性，分析物和內(nèi)標分離度高且保留時間短，可以滿足本實驗低濃度藥物測定的需要。

本研究結(jié)果顯示，阿德福韋的血漿藥-時曲線呈現(xiàn)單峰，毒代動力學(xué)符合權(quán)重因子為1/C2的二室模型，與文獻報道一致［15］。峰濃度指藥物給藥后達到的最高血藥濃度，若超出安全范圍則顯示毒性反應(yīng)。阿德福韋與黃芪甲苷聯(lián)用后，阿德福韋的峰濃度降低了43.15%，提示黃芪甲苷可以降低阿德福韋的血藥濃度。血漿清除率反映機體清除藥物的能力，黃芪甲苷干預(yù)后，阿德福韋的血漿清除率增加了41.50%，表明黃芪甲苷可以加快阿德福韋的消除，減少其在體內(nèi)中的蓄積。毒代動力學(xué)實驗結(jié)果提示，黃芪甲苷對阿德福韋的大鼠體內(nèi)處置過程有一定的影響，可顯著加快阿德福韋的排泄并降低其血藥濃度，基于此本研究進一步探討了其分子機制。

阿德福韋主要經(jīng)腎排泄，當(dāng)阿德福韋在腎中富集作用增強而排泄受阻時，會導(dǎo)致藥物蓄積，產(chǎn)生腎毒性［16］。近年來大量研究表明，阿德福韋所致腎毒性與攝取型轉(zhuǎn)運體Oat介導(dǎo)其在腎小管的大量聚集以及外排型轉(zhuǎn)運體Mrp介導(dǎo)其外排有關(guān)，且抑制Oat對藥物的攝取和促進Mrp對藥物的外排是降低腎毒性的有效策略［17-18］。Uwai等［19］研究證實，阿德福韋為Oat1和Oat3的底物，能被其從血液中攝取進入腎小管上皮細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，阿德福韋本身即可增強腎Oat1和Oat3mRNA表達，這可能是其長期使用造成腎蓄積的原因。當(dāng)蓄積于細胞內(nèi)的藥物濃度過大時，阿德福韋與線粒體DNA聚合酶結(jié)合，抑制線粒體DNA的合成，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，從而影響腎小管的重吸收和分泌功能，引起腎毒性［20］。同時，本研究結(jié)果表明，黃芪甲苷能夠降低腎組織中Oat3mRNA表達，從而減少阿德福韋攝取進入腎細胞，而且黃芪甲苷因具有酚羥基結(jié)構(gòu)，可以推測其在體內(nèi)以陰離子形式存在，與阿德福韋同屬于有機陰離子化合物，故可以競爭性抑制轉(zhuǎn)運體Oat3對阿德福韋的攝取，減少阿德福韋腎蓄積。另有研究報道，Mrp4參與了阿德福韋的外排過程［21］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，阿德福韋組Mrp4mRNA表達略有下降，而黃芪甲苷可提高Mrp4mRNA表達，從而促進阿德福韋從腎小管上皮細胞的外排。推測黃芪甲苷通過減少攝取、增加外排來減輕阿德福韋腎蓄積，從而減輕腎毒性。

綜上，本研究建立了快速、靈敏的UPLC-MS/MS法用于大鼠體內(nèi)阿德福韋濃度測定。結(jié)果提示，黃芪甲苷可改變阿德福韋的毒代動力學(xué)行為，且可通過減少腎小管上皮細胞Oat3 mRNA的表達、增加Mrp4 mRNA的表達降低阿德福韋在腎中的蓄積。本研究為臨床使用黃芪甲苷防治阿德福韋致腎毒性提供了實驗依據(jù)。