孫陽陽，王 倩，孫明堯，王小寧，劉鳳英，王 帥，楊維杰，王道輝，張敏敏，駱 媛，王永安

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.中國人民解放軍96604部隊(duì)醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730030）

百草枯（paraquat，PQ）是一種廣泛應(yīng)用的速殺型除草劑，對人畜具有高毒性。肺是PQ中毒的主要靶器官，中毒早期可引起肺泡炎、肺水腫、肺出血等癥狀，度過急性期后往往發(fā)展為肺纖維化。組織受損時(shí)，巨噬細(xì)胞一方面產(chǎn)生活性氧及其他毒性介質(zhì)影響正常代謝，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重組織損傷；另一方面又會(huì)產(chǎn)生胰島素樣生長因子1、血管內(nèi)皮生長因子α和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖及成纖維細(xì)胞活化［1-3］。TGF-β通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化、遷移、侵襲或增生性改變，在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中起主導(dǎo)作用［4］。研究表明，TGF-β通過激活Smad2/3、絲裂原活化蛋白激酶等信號(hào)通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，并使α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)增加，分泌大量Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白及纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，肺泡正常結(jié)構(gòu)被破壞，影響氣體交換，最終導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡［5-6］。PQ中毒患者和動(dòng)物肺組織中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞聚集［7］，提示其可能在PQ所致肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用Tran?swell技術(shù)建立人胚肺成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，并使用PQ染毒構(gòu)建肺纖維化細(xì)胞模型，以探討巨噬細(xì)胞參與PQ所致肺纖維化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5和人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。MEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清，美國賽默飛公司；佛波酯（phor?bol 12-myristate-13-acetate，PMA），美國Sigma公司；Trizol，美國Invitrogen公司；Prime ScriptR RT試劑盒、gDNA及 SYBR Premix Ex TaqTM，日本TaKaRa公司；兔抗人TGF-β、α-SMA、Smad2、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phos?phate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（一抗），英國Abcam公司；兔抗人纖連蛋白單克隆抗體（一抗），美國Immunoway公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Alexa FluorTM 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽和Hoechst33342，美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒，日本同仁公司；TGF-β抑制劑GW788388，美國Selleck公司。CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、MyCycler梯度PCR儀、垂直板電泳槽、PowerPac?HC穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及Trans-Blot SD半干電轉(zhuǎn)儀，美國 Bio-Rad 公司；24 mm Transwell，美國康寧公司；引物購自中國北京擎科生物科技有限公司；TGF-β引物序列為：正向，GCTGCTGTGGC?TACTGGTG；反向，CATAGATTTCGTTGTGGGTTTC；GAPDH：正向，AACGGATTTGGTCGTATTG，反向，GCTCCTGGAAGATGGTGAT。

1.2 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

將對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞離心，棄上清，用含有PMA 320 nmol·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，按1.0×109L-1細(xì)胞接種至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。若細(xì)胞由懸浮生長轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁成簇生長，并伸出偽足，則表示THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞［8］。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

取1.2誘導(dǎo)分化的對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞消化、離心、重懸，計(jì)數(shù)后以1×109L-1接種于96孔板，每孔 100 μL。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。待細(xì)胞貼壁生長密度為80%時(shí)吸棄培養(yǎng)基，染毒組分別加入含PQ 20，40，60，80，100，120，140，160和180 μmol·L-1（終濃度）的完全培養(yǎng)基〔RPMI 1640和MEM培養(yǎng)基（V∶V=1∶1），含10%FBS〕100 μL，細(xì)胞對照組加入100 μL不含PQ的完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)空白組（不含細(xì)胞），每組設(shè)6復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔吸光度（A450nm）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A450nm-空白組A450nm）/（細(xì)胞對照組A450nm-空白對照組A450nm）×100%。

1.4 巨噬細(xì)胞與MRC-5細(xì)胞共培養(yǎng)體系及肺纖維化細(xì)胞模型的建立

用孔徑0.4 μm的6孔Transwell小室構(gòu)建巨噬細(xì)胞與MRC-5細(xì)胞交互作用的共培養(yǎng)體系。MRC-5和1.2誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞用胰酶消化、離心、棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸后，MRC-5細(xì)胞以1×108L-1接種于Transwell下室，每孔 2.6 mL；巨噬細(xì)胞以1×109L-1接種于Transwell上室，每孔1.5 mL；培養(yǎng)24 h后為共培養(yǎng)體系。PQ染毒組更換為含PQ（終濃度為75，100和125 μmol·L-1）的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞對照組更換為完全培養(yǎng)基，GW788388干預(yù)組更換為含PQ（終濃度100μmol·L-1）和GW788388（終濃度10 μmol·L-1）的完全培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 Western印跡法檢測巨噬細(xì)胞TGF- β和MRC-5細(xì)胞 α-SMA、Smad2 、MMP-9和纖連蛋白表達(dá)

收集1.4分組處理的上、下室細(xì)胞，分別加入100 μL細(xì)胞裂解液。充分裂解后，4℃，12 000×g離心5 min取上清，用BCA法測定總蛋白濃度，并用上樣緩沖液和裂解液對各組蛋白定量并煮沸變性；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫振蕩2～3 h進(jìn)行封閉。取出PVDF膜，分別加入抗 α-SMA、Smad2、MMP-9、TGF-β、纖連蛋白和GAPDH單克隆抗體（1∶1000）溶液，4℃孵育過夜，TBST常溫振蕩漂洗5 min，漂洗5次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶2000）溶液，室溫孵育1 h，用TBST常溫振蕩5 min，漂洗5次。ECL化學(xué)發(fā)光成像后，用Quanti?tyOne圖像分析軟件對蛋白條帶積分吸光度（inte?grated abosorbance，IA）值進(jìn)行半定量分析，目的蛋白相對表達(dá)水平以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶IA比值表示。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）檢測MRC-5細(xì)胞和巨噬細(xì)胞TGF- β mRNA表達(dá)

取1.4分組處理的上、下室細(xì)胞，棄上、下室培養(yǎng)上清，并用預(yù)冷的PBS清洗1次。各小室加入0.5 mL Trizon反復(fù)吹打后移至1.5 mL EP管中，室溫靜置5 min后加入0.25 mL三氯甲烷，振蕩15 s；靜置3 min后12 000×g，4℃離心15 min；取上清加入0.25 mL異丙醇，混勻后靜置10 min，12 000×g，4℃離心10 min；棄上清后加入75%乙醇12 000×g，4℃離心6 min；棄上清后室溫干燥5 min；加入20 μL無RNA酶H2O溶解并檢測mRNA濃度。按說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，于96孔板中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TGF-β mRNA表達(dá)檢測采用SYBRgreen熒光標(biāo)記法，擴(kuò)增過程采取兩步法：95℃5 min預(yù)變性；（95℃10 s→60℃ 30 s）共 40個(gè)循環(huán)反應(yīng)；95℃，15 s；59.5℃，60 s；95℃ 15 s進(jìn)行溶解曲線分析。目的基因相對表達(dá)水平用2-ΔCt表示。

1.7 免疫熒光染色法檢測MRC-5細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）的表達(dá)

取1.4處理的下室MRC-5細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷的PBS迅速漂洗下室3次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次；加0.1% Triton X-100透化細(xì)胞膜20 min；PBS漂洗3次；再用5%牛血清白蛋白封閉1 h，吸棄液體；滴加稀釋的鬼筆環(huán)肽染液（0.25 mg·L-1），室溫孵育45 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加Hoechst33342避光孵育5 min，進(jìn)行核染；用PBS漂洗4次（每次5 min）洗去剩余的Hoechst33342，熒光顯微鏡下觀察MRC-5細(xì)胞綠色熒光的變化，拍照并記錄。采用imagepro-Plus 6.0圖像分析軟件對各組圖像進(jìn)行分析，計(jì)算各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的鑒定

經(jīng)PMA誘導(dǎo)24 h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，THP-1細(xì)胞由懸浮生長（圖1A）轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁成簇生長，并伸出偽足（圖1B），表示細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，可用于以下實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 Macrophages differentiated from THP-1 cells induced by phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）for 24 h.THP-1 cells were treated with PMA 320 nmol·L-1for 24 h before cell morphology was identified by microscope.A：spherical THP-1 cells growing in suspension；B：macro?phages growing adherently and extending pseudopods after PMA induction.The white arrows indicate pseudopodia.

2.2 PQ降低巨噬細(xì)胞存活率

CCK-8結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對照組相比，PQ 20 ～180 μmol·L-1作用于巨噬細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），半數(shù)抑制濃度（IC50）為 57.13 μmol·L-1。

Fig.2 Effect of parquat（PQ）on cell viability of macro?phages by CCK-8 assay.Macrophages were treated with PQ 20，40，60，80，100，120，140，160 and 180 μmol·L-1for 48 h before the cell vibility was detected by CCK-8 assay.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

2.3 PQ和TGF- β受體抑制劑GW788388對共培養(yǎng)體系MRC-5細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，PQ染毒后MRC-5細(xì)胞α-SMA和纖連蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與PQ染毒組相比，TGF-β受體抑制劑GW788388處理后，α-SMA和纖連蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。

Fig.3 Effect of PQ and GW788388 on protein expres?sion of α -smooth muscle actin( α -SMA)and fibronectin in MRC-5 cells detected by Western blotting.The co-cul?ture systerm was treated with PQ 100 μmol·L-1or PQ 100 μmol·L-1 withGW788388 10 μmol·L-1for 48 h.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PQ group.

2.4 PQ對共培養(yǎng)體系中MRC-5細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響

圖4結(jié)果顯示，PQ染毒巨噬細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞共培養(yǎng)體系48 h后，用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色MRC-5細(xì)胞。與細(xì)胞對照組相比，PQ染毒組MRC-5細(xì)胞中熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.01）；與PQ染毒組相比，GW788388處理后MRC-5細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of PQ and GW788388 on expression of F-actin in MRC-5 cells detected by immunofluores?cence assay.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PQ group.

2.5 PQ對巨噬細(xì)胞TGF- β mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖5結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞暴露于PQ 75，100和 125 μmol·L-148 h，與細(xì)胞對照組相比，PQ 100 μmol·L-1組TGF-β mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。Western印跡結(jié)果（圖6）亦表明，與細(xì)胞對照組相比，PQ 100和125 μmol·L-1組 TGF-β 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of PQ on transforming growth factor- β（TGF- β）mRNA expression in macrophages detected by qRT-PCR.The co-culture systerm was treated with PQ for 48 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01 ，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

Fig.6 Effect of PQ on TGF- β protein expression in macrophages detected by Western bloting.See Fig.5 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

圖7結(jié)果顯示，細(xì)胞對照組巨噬細(xì)胞TGF-β mRNA表達(dá)顯著高于MRC-5細(xì)胞；PQ染毒48 h后2種細(xì)胞TGF-β mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）。

Fig.7 Effect of PQ on TGF- β mRNA expression in macrophages and MRC-5 cells detected by qRT-PCR.The co-culture systerm was treated with PQ 100 μmol· L-1for 48 h.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with MRC-5 cell control group；##P＜0.01，compared with macrophages control group.

2.6 PQ和GW788388對MRC-5細(xì)胞TGF- β/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

圖8結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，PQ染毒后MRC-5細(xì)胞Smad2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與PQ染毒組相比，GW788388處理后，Smad2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

Fig.8 Effect of PQ and GW788388 on protein expres?sion of matrixmetalloprotein-9(MMP-9)and Smad2 in MRC-5 cells detected by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding cell control group；#P＜0.05，compared with corresponding PQ group.

3 討論

PQ是一種高毒速殺型除草劑，每年因誤服或自服PQ導(dǎo)致的中毒事件屢有發(fā)生。PQ中毒易致肺纖維，但其機(jī)制尚未明確。既往關(guān)于PQ中毒致肺纖維化的研究多局限于肺上皮細(xì)胞的損傷及損傷后細(xì)胞因子對成纖維細(xì)胞的調(diào)控［10-11］，對巨噬細(xì)胞在此過程的作用尚未闡明。本研究基于Tran?swell技術(shù)建立PQ誘導(dǎo)肺纖維化細(xì)胞模型，探討巨噬細(xì)胞參與PQ中毒致肺纖維化的作用機(jī)制。

PQ中毒所致肺纖維化是一種涉及多種細(xì)胞類型和細(xì)胞通路的復(fù)雜病理過程，在此過程中巨噬細(xì)胞可以通過多種細(xì)胞因子調(diào)控肺成纖維細(xì)胞激活并分泌細(xì)胞外基質(zhì)。有鑒于此，基于單一類型細(xì)胞構(gòu)建的體外模型不能很好地反映整個(gè)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，基于此類模型研究疾病的發(fā)生機(jī)制也具有一定的局限性。因此，構(gòu)建巨噬細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系，研究細(xì)胞間通訊在肺成纖維化機(jī)制中的作用，對于闡明PQ中毒所致肺纖維化機(jī)制非常重要。本研究利用Transwell小室將巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞分開培養(yǎng)，2種細(xì)胞通過分泌于培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子和代謝產(chǎn)物等完成細(xì)胞間的交流。這種無需接觸既可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間交互作用的系統(tǒng)，既避免了細(xì)胞接觸所介導(dǎo)的生長抑制效應(yīng)，又可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)對2種細(xì)胞的通訊作用。

在多種特發(fā)性肺纖維化體外、體內(nèi)模型中均發(fā)現(xiàn)，TGF-β是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞因子之一。以往多項(xiàng)研究表明，巨噬細(xì)胞是肺纖維化發(fā)展過程中TGF-β的主要來源［12-13］。此外，在正常肺實(shí)質(zhì)組織中，TGF-β只分布于肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞。本研究RT-PCR結(jié)果也表明，TGF-β在共培養(yǎng)體系中呈現(xiàn)出表達(dá)的空間特異性，即在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量約為MRC-5細(xì)胞的21倍。在PQ染毒共培養(yǎng)體系48 h后，TGF-β在2種細(xì)胞中的表達(dá)均顯著增加，但仍以巨噬細(xì)胞表達(dá)為主，其表達(dá)量約為MRC-5細(xì)胞的7倍。為此認(rèn)為，在本研究所建立的模型中，巨噬細(xì)胞通過旁分泌TGF-β刺激肺成纖維細(xì)胞活化而發(fā)揮促進(jìn)肺纖維化的作用。

本研究所構(gòu)建的共培養(yǎng)體系中，暴露PQ 48 h，巨噬細(xì)胞TGF-β表達(dá)顯著增加，并通過上調(diào)TGF-β/Smads通路相關(guān)蛋白Smad2誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞。此外，MRC-5細(xì)胞纖維化標(biāo)志物纖連蛋白、α-SMA和纖維狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)顯著增高，表明巨噬細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞共培養(yǎng)體系暴露于PQ，肺纖維化細(xì)胞模型構(gòu)建成功。同時(shí)用TGF-β受體抑制劑GW788388處理，可顯著降低TGF-β/Smads通路相關(guān)蛋白及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)一步提示PQ可能直接刺激巨噬細(xì)胞高表達(dá)TGF-β，TGF-β通過激動(dòng)TGF-β/Smads通路而活化成纖維細(xì)胞，活化后的成纖維細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致肺纖維化。以往報(bào)道，PQ通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷肺泡上皮細(xì)胞，損傷后的肺上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β及其他細(xì)胞因子，繼而活化成纖維細(xì)胞引起肺纖維化［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PQ可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β而參與PQ中毒致肺纖維化的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明，PQ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β，刺激肺成纖維細(xì)胞活化，活化后的成纖維細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)；TGF-β受體抑制劑GW788388可拮抗肺成纖維細(xì)胞的活化，并減少TGF-β下游蛋白和纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。由此推測，巨噬細(xì)胞可通過旁分泌TGF-β激活肺成纖維細(xì)胞TGF-β/Smads通路而促進(jìn)肺纖維化。本研究可為PQ中毒致肺纖維化機(jī)制及PQ中毒治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)。