王麗娟，董小鵬，杜 弢

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020）

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺部疾病的共同結(jié)局，一旦形成很難逆轉(zhuǎn)，其死亡率甚至高于某些癌癥［1]。目前，肺纖維化常用的治療藥物如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等毒副作用較大。研究表明，中草藥在治療肺纖維化方面有一定應(yīng)用價(jià)值［2-4]，當(dāng)歸與川芎單獨(dú)使用時(shí)對(duì)于肺纖維化有作用，但兩者合用時(shí)能否起到協(xié)同作用尚未有實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本研究通過檢測(cè)當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺纖維化模型大鼠肺功能、肺組織病理形態(tài)學(xué)改變、肺組織TGF-β1/Smad 信號(hào)通路的影響，以篩選兩者最佳配比，并探討其潛在機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠80 只，雄性，體質(zhì)量（160±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2015-0002。

1.2 試劑與藥物 博來霉素（北京索萊寶科技有限公司）；醋酸潑尼松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司）。當(dāng)歸、川芎均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的根、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖。TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA一抗，二抗、SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒（AR1022）（武漢博士德生物工程有限公司）；TRIzol（美國Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑（日本TaKaRa 公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成）。

1.3 儀器 WPB PLT-UNR-RT-2 型動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)（法國EMKA 公司）；Vanox 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國Heraeus 公司）；680 型全波長酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國Bio-Rad 公 司）；Applied Biosystems Step One PlusTM型實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國Agilent 公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 稱取一定量當(dāng)歸、川芎、兩者不同配比（2∶1、1∶1、1∶2）的混合藥材，按照常規(guī)法制備相應(yīng)水煎液，即得。

2.2 分組及建模 將大鼠隨機(jī)分為8 組，即正常對(duì)照組，肺纖維化模型組，強(qiáng)的松組（陽性對(duì)照組），當(dāng)歸組，川芎組，當(dāng)歸、川芎（2∶1、1∶1、1∶2）水煎液給藥組，每組10 只，采用博來霉素氣管內(nèi)滴入法制備肺纖維化模型［5-6]。大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后仰臥固定，無菌操作下作約0.5～1 cm 頸中切口。逐層剝離暴露氣管，用1 mL 注射器刺入氣管，快速推注鹽酸博來霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL（劑量為5 mg/mL，按5 mg/kg 體質(zhì)量給藥），而正常對(duì)照組氣管內(nèi)注入等量生理鹽水，縫合皮膚后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

2.3 給藥 造模后第2 天，當(dāng)歸、川芎各給藥組大鼠按照正常成人每1 kg 體質(zhì)量用藥量的15 倍計(jì)算，強(qiáng)的松組以5 mg/kg 劑量灌胃，而正常組和肺纖維化模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)4 周。

2.4 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束并檢測(cè)肺功能后，大鼠股動(dòng)脈取血，分離血清，-20 ℃冰箱凍存。處死大鼠并迅速分離雙肺，每組取5 只用于制備肺泡灌洗液，剩余5 只取左肺上葉，10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，用于組織病理學(xué)及免疫組化檢測(cè)；取左肺下葉制備肺組織勻漿，用于羥脯胺酸水平檢測(cè)；取右肺上葉液氮凍存，用于RT-PCR檢測(cè)。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 肺功能指標(biāo) 末次給藥后1 h 每組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后插入氣管插管，將其仰臥位固定在小動(dòng)物呼吸機(jī)的密閉體積描記箱平板上，檢測(cè)頻率、吸氣時(shí)間、呼氣時(shí)間、每分鐘通氣量。

2.5.2 肺泡灌洗液中炎癥因子水平 采用ELISA試劑盒，檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 水平。

2.5.3 肺組織羥脯胺酸水平 采用相應(yīng)試劑盒，進(jìn)行肺組織勻漿中羥脯胺酸水平的檢測(cè)。

2.5.4 肺組織病理形態(tài)學(xué) 石蠟切片行常規(guī)HE及Masson 染色，每張切片選取上、下、左、右、中5 個(gè)視野，參考Szapiel［7]等報(bào)道，分別用HE、Masson 染色計(jì)算肺泡炎、肺纖維化積分。

2.5.5 肺組織TGF-β1/Smad 信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá) 采用免疫組化法，檢測(cè)正常對(duì)照組、肺纖維化模型組、當(dāng)歸、川芎1∶2 組大鼠肺組織TGFβ1、Smad2、Smad3、α-SMA 表達(dá)。以棕黃色為陽性染色，在400 倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，用Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統(tǒng)軟件測(cè)定累積光密度值（IOD），取平均值。

2.5.6 肺組織TGF-β1/Smad 信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA 表達(dá) 用TRIzol 法從大鼠肺組織中提取出總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 并以其為模板，采用兩步法進(jìn)行PCR 反應(yīng)（75 ℃，120 s；95 ℃，5 min；60 ℃，60 s；72 ℃，30 s），共40 個(gè)循環(huán)，以βactin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，正態(tài)分布以（）表示，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肺功能指標(biāo) 與正常對(duì)照組比較，肺纖維化模型組大鼠各項(xiàng)肺功能指標(biāo)出現(xiàn)異常，強(qiáng)的松組和當(dāng)歸、川芎組可改善上述部分指標(biāo)，以當(dāng)歸、川芎1∶2 組作用最明顯，見表2。

表2 當(dāng)歸、川芎不同配比對(duì)麻醉大鼠肺功能指標(biāo)的影響（，n=5）Tab.2 Effects of different proportions of Angelica sinensis and Chuanxiong on pulmonary function indices in anesthetized rats（，n=5）

表2 當(dāng)歸、川芎不同配比對(duì)麻醉大鼠肺功能指標(biāo)的影響（，n=5）Tab.2 Effects of different proportions of Angelica sinensis and Chuanxiong on pulmonary function indices in anesthetized rats（，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響 肺纖維化模型大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6、NF-κB 高于正常對(duì)照組；強(qiáng)的松組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平下降，介于正常對(duì)照組及模型組之間；當(dāng)歸組、川芎組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6、NFκB 水平接近模型組，高于正常對(duì)照組，以當(dāng)歸、川芎1∶2 組抗炎作用較為明顯，見表3。

表3 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響（，n=5）Tab.3 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of rats with pulmonary fibrosis（，n=5）

表3 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響（，n=5）Tab.3 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of rats with pulmonary fibrosis（，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺組織羥脯胺酸水平的影響 肺纖維化模型組大鼠羥脯胺酸水平高于正常對(duì)照組，而當(dāng)歸、川芎1∶2 組水平減少，與肺纖維化模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05，P＜0.01），其余各給藥組均高于正常對(duì)照組，見表4。

表4 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)羥脯胺酸水平的影響（，n=5）Tab.4 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the level of hydroxyproline（，n=5）

表4 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)羥脯胺酸水平的影響（，n=5）Tab.4 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the level of hydroxyproline（，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05。

3.4 肺組織組織病理學(xué)觀察 正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小均勻，肺泡間隔無增厚及炎性細(xì)胞侵潤，Masson 染色顯示肺血管壁和氣管周圍及肺泡間隔可見少量藍(lán)色膠原纖維沉積，無肺泡炎及肺纖維化表現(xiàn)；肺纖維化模型組大鼠肺泡大小不等，結(jié)構(gòu)破壞明顯，部分肺泡腔呈囊狀擴(kuò)張或萎陷，肺泡間隔增寬，肺泡壁增厚，有較多炎性細(xì)胞侵潤，肺間質(zhì)可見大量的成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)堆積，Masson 染色可見肺血管壁、支氣管壁和肺泡間隔有大量藍(lán)色膠原纖維沉積，表明大鼠肺纖維化模型構(gòu)建成功；強(qiáng)的松組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，部分肺泡萎陷，肺泡間隔縮小，少量炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織增生較模型組減輕，Masson 染色可見肺泡間隔膠原纖維表達(dá)較模型組顯著減少；當(dāng)歸、川芎組及兩者不同配比組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞較輕，有部分局灶性改變，肺泡間隔輕度增厚、少量成纖維細(xì)胞增生，部分可見中性粒細(xì)胞等早期炎性細(xì)胞數(shù)量，Masson 染色可見藍(lán)色膠原沉積及梭形的成纖維細(xì)胞，以1∶2 組織病理學(xué)改變最輕。見圖1～2。

圖1 各組HE 染色結(jié)果（×400）Fig.1 Results of HE staining in various groups（×400）

圖2 各組Masson 染色結(jié)果（×400）Fig.2 Results of Masson staining in various groups（×400）

3.5 肺泡炎和肺纖維化分級(jí)計(jì)分的定量分析結(jié)果 模型組大鼠肺泡炎及肺纖維化計(jì)分高于正常對(duì)照組，提示模型制備成功；強(qiáng)的松組大鼠肺泡炎及肺纖維化計(jì)分低于肺纖維化模型組；當(dāng)歸、川芎配伍后，肺泡炎及肺纖維化計(jì)分有下降趨勢(shì)，以1∶2組更明顯，見表5。

表5 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺纖維化積分的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the pulmonary fibrosis grading（，n=5）

表5 當(dāng)歸、川芎及其不同配比對(duì)肺纖維化積分的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the pulmonary fibrosis grading（，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，*P＜0.05。

3.6 當(dāng)歸川芎1∶2 配比對(duì)肺組織TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響 模型組關(guān)鍵分子的mRNA 及蛋白表達(dá)均高于正常對(duì)照組，而當(dāng)歸、川芎1∶2 組關(guān)鍵分子表達(dá)下降，見圖3～6、表6～7。

表6 當(dāng)歸、川芎聯(lián)用對(duì)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA 表達(dá)的影響（，n=5）Tab.6 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule mRNA expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

表6 當(dāng)歸、川芎聯(lián)用對(duì)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA 表達(dá)的影響（，n=5）Tab.6 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule mRNA expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖3 各組TGF-β1 免疫組化染色結(jié)果（×400）Fig.3 Results of immunohistochemical staining for TGF-β1 in various groups（×400）

圖4 各組Smad2 免疫組化染色結(jié)果（×400）Fig.4 Results of immunohistochemical staining for Smad2 in various groups（×400）

圖5 各組Smad3 免疫組化染色結(jié)果（×400）Fig.5 Results of immunohistochemical staining for Smad3 in various groups（×400）

圖6 各組α-SMA 免疫組化染色結(jié)果（×400）Fig.6 Results of immunohistochemical staining for α-SMA in various groups（×400）

3 討論

肺纖維化主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞增殖、大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）聚集并伴有炎性損傷和嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)破壞，肺泡呈進(jìn)行性和不可逆性瘢痕化，使得肺泡上皮細(xì)胞面積減少，最終導(dǎo)致呼吸衰竭［8]。中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，從中尋找治療肺纖維化的有效藥物是一種切實(shí)可行的思路，益氣活血通絡(luò)法是治療本病的共識(shí)，活血化瘀法貫徹始終［9-10]。當(dāng)歸和川芎都具有活血化瘀的功效，兩者組成的藥對(duì)是臨床中常見的配伍形式。當(dāng)歸及其復(fù)方具有抗肺纖維化的作用［11-12]，川芎也可作為肺纖維化的臨床輔助治療藥物［13]，但藥對(duì)是否也具有相同作用尚未見有報(bào)道。

表7 當(dāng)歸、川芎聯(lián)用對(duì)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響（，n=5）Tab.7 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule protein expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

表7 當(dāng)歸、川芎聯(lián)用對(duì)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響（，n=5）Tab.7 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule protein expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05。

大量研究表明，肺纖維化的發(fā)生機(jī)制主要與早期的炎癥反應(yīng)和隨后的纖維化增生有關(guān)［14]。NFκB 信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因素，很多抗肺纖維化治療的藥物都以該通路及通路中的重要分子如TNF-α、NF-κB 等為靶點(diǎn)［15-16]。而在隨后的纖維化階段，TGF-β1 則是啟動(dòng)和進(jìn)程的關(guān)鍵因子。Smad2、Smad3 是TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的分子，可結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)反向基因的轉(zhuǎn)錄［17-18]。抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路也成為肺纖維化治療的一個(gè)角度［19]。此外，在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB 信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)反向TGF-β1/Smad 信號(hào)通路［20]，正成為肺纖維化治療的重要靶點(diǎn)。

本研究首先對(duì)當(dāng)歸川芎以臨床常用的幾種比例進(jìn)行配伍，以肺功能、肺組織羥脯胺酸、肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 水平、肺組織病理學(xué)評(píng)分為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸川芎配伍使用時(shí)具有一定治療肺纖維化的作用，其中當(dāng)歸川芎以1∶2 配伍時(shí)療效優(yōu)于其余兩種配伍方式。隨后，以TGF-β1 信號(hào)通路的關(guān)鍵分子TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA 為檢測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸川芎以1∶2 配伍時(shí)對(duì)該通路有部分阻斷作用，呈現(xiàn)治療肺纖維化的潛在價(jià)值。

綜上所述，TGF-β1/Smad 信號(hào)通路的激活是肺纖維化的致病因素之一，當(dāng)歸川芎以1∶2 配伍使用時(shí)能有效改善肺功能及減輕組織病理學(xué)改變可能與其抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路有關(guān)，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。