馬媛媛，姚曉英，談卓臣，廖茂行

（上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508）

學(xué)習(xí)記憶障礙是指近期記憶不能轉(zhuǎn)入長時記憶及對以往儲存的信息提取困難的癥狀，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1]，隨著人口的老齡化其發(fā)病比例不斷增加，對老年人的影響日益嚴(yán)重。學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有的治療藥物主要包括抗氧化劑、自由基清除劑、腦代謝調(diào)節(jié)劑、減緩谷氨酸傳遞及改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)類藥物，但效果難以讓人滿意［2]。中藥及其復(fù)方制劑不良反應(yīng)小，對疾病的多個途徑、多個靶點(diǎn)均有干預(yù)作用，并對學(xué)習(xí)記憶障礙的治療具有較大優(yōu)勢［3]。

地黃應(yīng)用歷史悠久，具有抗老年癡呆、治療糖尿病、補(bǔ)血、滋陰等諸多藥理作用，環(huán)烯醚萜苷類、糖類等是其主要活性成分［4]。研究發(fā)現(xiàn)，地黃中的寡糖成分可以改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制與減少神經(jīng)元凋亡、降低氧化應(yīng)激水平及提高乙酰膽堿含量有關(guān)［5-6]，而多糖成分具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和血脂、增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)造血功能、抗腫瘤及促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖等作用［7]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)地黃多糖提高學(xué)習(xí)記憶能力方面的報道，故本實(shí)驗(yàn)擬研究該成分是否具有改善東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙作用，并初步探討分子機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明種小鼠80 只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由菲諾克生物科技（上海）有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0005。

1.2 試劑與藥物 地黃多糖為淡黃色粉末，經(jīng)苯酚硫酸法測定總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90% 以上，由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提供（批號20190126）。多奈哌齊（陜西方舟制藥有限公司，批號20190224）；氫溴酸東莨菪堿（上海晶純生化科技股份有限公司）；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性檢測試劑盒（批號20190518、20190615，泉州市九邦生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）水平檢測試劑盒（批號S0109、S0051、S0131M，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平檢測試劑盒（批號H052、H002，南京建成生物工程研究所）；兔源核因子κB p65（NF-κB p65）、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）及 β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號ab16502、ab7217、ab8227，英國Abcam 公司）；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號C020208，洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心有限公司）。

1.3 儀器 ML104/02 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Spectra Max M5 型多功能酶標(biāo)儀（美國MD 公司）；低溫高速多功能離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；小型垂直蛋白電泳儀（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 分組、給藥與建模 80 只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥多奈哌齊組（3 mg/kg）及地黃多糖高（30 mg/kg）、低（15 mg/kg）劑量組，每組16 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始給藥。正常組及模型組小鼠灌胃同體積的生理鹽水，連續(xù)28 d。自第24 天開始，于灌胃給藥結(jié)束30 min 后正常組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL，其余各組均腹腔注射3 mg/kg 氫溴酸東莨菪堿，連續(xù)5 d。

2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 末次注射氫溴酸東莨菪堿后30 min，通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)開展學(xué)習(xí)能力和記憶能力測試。安全平臺位于第Ⅲ象限中央，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限的中央處將小鼠放入水池，每次訓(xùn)練時間90 s，每天3 次，連續(xù)5 d。如果小鼠找到安全平臺時間少于90 s，則記錄實(shí)際尋找平臺所需時間，即為逃避潛伏期；如果找到安全平臺時間大于90 s，則需將其引致安全平臺，逃避潛伏期記為90 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)完成后開始，于第Ⅰ象限的中央處將小鼠放入水池，觀察90 s 內(nèi)在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限的停留時間、首次穿越平臺時間、穿越平臺次數(shù)。

2.3 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)檢測 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，各組隨機(jī)取8 只小鼠，頸椎脫臼法處死，無菌操作分離腦組織，快速分離海馬，加入預(yù)冷的生理鹽水制備10% 組織勻漿液，12 000 r/min 離心10 min。用微量移液器槍頭小心吸取上清液，在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法，參照試劑盒操作步驟檢測海馬組織 ChAT、AChE、SOD、CAT 活性 及 MDA、TNF-α、IL-1β 水平。

2.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)后各組取剩余8 只小鼠，頸椎脫臼法處死，無菌操作分離腦組織，快速分離海馬置于研缽中，緩慢加入液氮并研磨，再加入組織裂解液，裂解30 min 后12 000 r/min 離心10 min，微量移液器槍頭小心吸取上清液，BCA 法檢測蛋白表達(dá)。在70 V 恒壓電泳下用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，手術(shù)刀片切取目的條帶，在300 mA 電流下將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚氯乙烯膜上，常溫下脫脂奶粉封閉1.5 h，漂洗后加入NF-κB p65、IκB-α 及β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，漂洗后再加入HRP標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光法顯色曝光，ImageJ 1.8.0 軟件分析蛋白灰度值，計算NFκB p65 及IκB-α 蛋白相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，組內(nèi)比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 地黃多糖對各組小鼠學(xué)習(xí)能力障礙的影響 模型組小鼠從第1 天到第5 天的逃避潛伏期與正常組比較均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠的逃避潛伏期均有一定程度的降低，其中陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高劑量組從第1 天開始，地黃多糖低劑量組從第2 天開始差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表明地黃多糖對東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)能力障礙具有改善作用。見表1。

表1 地黃多糖對各組小鼠學(xué)習(xí)能力障礙的影響（，n=16）Tab.1 Effects of RGLPs on learning impairment of mice in various group（，n=16）

表1 地黃多糖對各組小鼠學(xué)習(xí)能力障礙的影響（，n=16）Tab.1 Effects of RGLPs on learning impairment of mice in various group（，n=16）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 地黃多糖對各組小鼠記憶能力障礙的影響 與正常組比較，模型組小鼠在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限停留時間及穿越平臺次數(shù)降低，而首次穿越平臺時間增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限停留時間及穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.01），而首次穿越平臺時間降低（P＜0.01）。見表2。

表2 地黃多糖對各組小鼠記憶能力障礙的影響（，n=16）Tab.2 Effects of RGLPs on memory impairment of mice in various group（，n=16）

表2 地黃多糖對各組小鼠記憶能力障礙的影響（，n=16）Tab.2 Effects of RGLPs on memory impairment of mice in various group（，n=16）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 地黃多糖對各組小鼠海馬組織ChAT 和AChE活性的影響 與正常組比較，模型組小鼠海馬組織ChAT 活性減少（P ＜0.01），而AChE 活性增加（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織ChAT 活性增加，而AChE 活性減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 地黃多糖對各組小鼠海馬組織ChAT、AChE 活性的影響（，n=8）Tab.3 Effects of RGLPs on ChAT and AChE activities in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

表3 地黃多糖對各組小鼠海馬組織ChAT、AChE 活性的影響（，n=8）Tab.3 Effects of RGLPs on ChAT and AChE activities in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 地黃多糖對各組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性減少（P ＜0.01），而MDA 水平增加（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織SOD、CAT活性增加，而MDA 水平降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 地黃多糖對各組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（，n=8）Tab.4 Effects of RGLPs on SOD，CAT activities and MDA level in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

表4 地黃多糖對各組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（，n=8）Tab.4 Effects of RGLPs on SOD，CAT activities and MDA level in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 地黃多糖對各組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平的影響 模型組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平與正常組比較升高（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表5。

表5 地黃多糖對各組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平的影響（，n=8）Tab.5 Effects of RGLPs on TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

表5 地黃多糖對各組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平的影響（，n=8）Tab.5 Effects of RGLPs on TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.6 地黃多糖對各組小鼠海馬組織NF-κB p65 及IκB-α 表達(dá)的影響 模型組小鼠海馬組織NF-κB p65 表達(dá)與正常組比較增加（P＜0.01），而IκB-α表達(dá)降低（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織NF-κB p65 表達(dá)降低，而IκB-α 表達(dá)增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1、表6。

表6 地黃多糖對各組小鼠海馬組織NF-κB p65 及IκB-α表達(dá)的影響（，n=8）Tab.6 Effects of RGLPs on NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

表6 地黃多糖對各組小鼠海馬組織NF-κB p65 及IκB-α表達(dá)的影響（，n=8）Tab.6 Effects of RGLPs on NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠海馬組織NF-κB p65、IκB-α 表達(dá)Fig.1 NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups

4 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，幾乎所有的腦區(qū)都受膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)支配，廣泛分布于嗅結(jié)節(jié)、紋狀體、基底前腦、中腦區(qū)、后腦、脊髓等，參與應(yīng)激反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶等重要生理過程［8]。ACh 是膽堿能系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，作為與學(xué)習(xí)記憶最密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，其水平高低決定著能力強(qiáng)弱［9]。ChAT 為ACh 的合成酶，可以催化膽堿與乙酰輔酶A 合成ACh；AChE 可以將ACh 分解為膽堿和乙酸，降低ACh 水平，ChAT 與AChE 的活性共同決定著其水平［10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖干預(yù)后東莨菪堿誘導(dǎo)的模型小鼠海馬組織ChAT 活性增加，而AChE活性減少，表明調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能是地黃多糖改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的潛在原因。

神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)獨(dú)特，更容易遭受氧自由基的攻擊，破壞DNA 等大分子結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和死亡，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙［11]。研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)抗氧化能力下降、自由基堆積，是造成神經(jīng)細(xì)胞毒性的重要原因，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶功能［12]。SOD 是體內(nèi)重要的抗氧化酶，在學(xué)習(xí)記憶能力障礙患者體內(nèi)其活性下降，自由基大量產(chǎn)生，引起腦組織功能受損［13]。CAT 可降低H2O2的濃度，從而有效緩解學(xué)習(xí)記憶能力障礙的發(fā)生與進(jìn)展［11]。MDA 可反映機(jī)體受自由基影響的程度，其本身也具有毒性，會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙患者神經(jīng)元細(xì)胞變性、凋亡及壞死［14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖干預(yù)后東莨菪堿誘導(dǎo)的模型小鼠海馬組織SOD、CAT 活性增加，而MDA 水平減少，表明抗氧化應(yīng)激是地黃多糖改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的潛在機(jī)制。

炎癥反應(yīng)在東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙過程中占有重要地位，在學(xué)習(xí)記憶能力障礙患者體內(nèi)TNF-α、IL-1β 水平升高［15]。研究發(fā)現(xiàn)［16]，益智護(hù)腦方可以通過降低昆明小鼠海馬組織中的TNF-α 及IL-1β 水平，緩解東莨菪堿所致記憶功能障礙。右美托咪定保護(hù)東莨菪堿導(dǎo)致的老年大鼠認(rèn)知功能障礙作用，也與減輕了炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平有關(guān)［17]；本研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平降低，表明抑制炎癥反應(yīng)與地黃多糖改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙作用密切相關(guān)。NF-κB 廣泛存在于體內(nèi)所有細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及活化，參與炎癥過程、神經(jīng)元可塑性、機(jī)體免疫及學(xué)習(xí)記憶等多種生理、病理過程［18]，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時被激活，促進(jìn)下游炎癥因子TNF-α 及IL-1β 水平的增加［19]。IκB-α 是NF-κB 的上游信號誘導(dǎo)物，為NF-κB 的重要抑制因子，其表達(dá)量增加有助于抑制炎癥反應(yīng)，緩解學(xué)習(xí)記憶能力障礙癥狀［20]。本研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖組小鼠海馬組織NF-κB p65 表達(dá)降低，而IκB-α 表達(dá)增加，進(jìn)一步表明地黃多糖可以下調(diào)NF-κB 信號通路的活化水平進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，地黃多糖可有效改善東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙，該作用與調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能、抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。