張 燕，齊紅杰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診，河南 鄭州 450000)

肝細(xì)胞癌是世界第四大惡性腫瘤，同時(shí)也是全球第三大癌癥死亡原因[1]。肝細(xì)胞癌起病隱匿，早期無(wú)特異性臨床特征，多數(shù)患者在確診時(shí)已進(jìn)展為中晚期，因此，肝細(xì)胞癌患者死亡率居高不下[2-3]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)肝細(xì)胞癌的治療方式越來(lái)越多，如經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞、靶向治療及射頻消融術(shù)等，在改善患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間方面取得較好的療效，但仍有部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡，預(yù)后較差[4-6]。而目前臨床尚無(wú)可用于評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的指標(biāo)，雖有部分腫瘤生物標(biāo)志物被用來(lái)預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后，如癌胚抗原，但其靈敏度較低，預(yù)測(cè)能力十分有限[7]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類(lèi)新型非編碼RNA，已有多種cricRNA被證實(shí)[8-10]參與肝細(xì)胞癌的病理生理進(jìn)程。然而關(guān)于hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系并未完全闡明。因此，筆者開(kāi)展本研究，以期為臨床預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性選取2015年8月至2016年8月間在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受治療的118例肝細(xì)胞癌患者作為研究對(duì)象。根據(jù)《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專(zhuān)家共識(shí)》[11]中關(guān)于肝細(xì)胞癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)疑似肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初次就診并經(jīng)病理活檢確診為肝細(xì)胞癌；(2)入組前未接受放化療、靶向治療等抗腫瘤治療；(3)術(shù)后接受規(guī)律隨訪；(4)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他部位惡性腫瘤；(2)合并重要器官功能不全；(3)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。118例肝細(xì)胞癌患者中，男性76例，女性42例，年齡47～74歲，平均年齡(63.82±5.74)歲，巴塞羅那(barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期A期78例，B期40例。本研究獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法采用qRT-PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者h(yuǎn)sa_circ_0001727的相對(duì)表達(dá)量。在無(wú)菌環(huán)境下將肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織用剪刀剪碎，用液氮研磨。取研磨液于試管中，4 ℃下4000 r/min離心15 min，取離心后上清液置于EP管中，待測(cè)。用TRIzol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠及紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度及純度，取總RNA 2 μL加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒中，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，最后PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。hsa_circ_0001727基因序列正向：5′-GAGGCCCAGCTCAGTGTG-3′，反向：5′-GGCTGCAATGGTCTTGTTGG-3′；以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH正向：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，反向：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示hsa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪采用門(mén)診及電話等方式對(duì)患者進(jìn)行為期三年的隨訪，了解患者生存情況，每月隨訪1次。起始時(shí)間為2015年9月5日，截止時(shí)間為2019年9月17日，中位隨訪時(shí)間為29個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織hsa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例或率[n(%)]表示，采用卡方檢驗(yàn)。用受試者工作特征曲線(ROC)分析hsa_circ_0001727評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的價(jià)值。采用Kaplan-Meier及Cox單因素及多因素回歸分析影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織中hsa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量比較肝細(xì)胞癌組織hsa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量為(0.87±0.32)低于癌旁組織(1.39±0.42)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.584，P<0.001)。

2.2 hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、腫瘤直徑、HbsAg及病灶位置無(wú)關(guān)(P>0.05)；而與BCLC分期、病灶數(shù)目、分化程度有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 hsa_circ_0001727評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的效能118例肝細(xì)胞癌患者1～3年生存率分別為84.75%(100/118)、75.42%(89/118)和68.64%(81/118)。死亡組患者h(yuǎn)sa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量為(1.16±0.28)低于生存組(1.51±0.41)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。hsa_circ_0001727評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的AUC、敏感度、特異性、最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為0.811[95%CI(0.72，0.877)]、94.59%、64.20%、1.45，見(jiàn)圖1。

圖1 hsa_circ_0001727評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的ROC曲線

2.4 影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的因素將性別(女=0，男=1)、年齡(<65歲=0，≥65歲=1)、體質(zhì)量指數(shù)(<24 kg/m2=0，≥24 kg/m2=1)、腫瘤直徑(<5 cm=0，≥5 cm=1)、HbsAg(陽(yáng)性=0，陰性=1)、BCLC分期(A期=0，B期=1)、病灶數(shù)目(單發(fā)=0，多發(fā)=1)、病灶位置(單側(cè)=0，雙側(cè)=1)、分化程度(高、中分化=0，低分化=1)、肝動(dòng)脈化療栓塞(是=0，否=1)、hsa_circ_0001727作為自變量，將肝細(xì)胞癌患者預(yù)后情況(生存=0，死亡=1)作為因變量納入Cox單因素回歸分析，結(jié)果顯示分化程度、肝動(dòng)脈化療栓塞及hsa_circ_0001727可能與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。按納入標(biāo)準(zhǔn)α≤0.10，將上述因素納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示肝動(dòng)脈化療栓塞及hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后密切相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的Cox回歸分析

3 討論

肝細(xì)胞癌具有惡性程度高，死亡率高的特點(diǎn)[12-13]。早期發(fā)現(xiàn)和早期治療是改善肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。此前，有研究利用腫瘤標(biāo)記物預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后，如甲胎蛋白，但其敏感度較低[14]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物來(lái)替代或聯(lián)合甲胎蛋白等指標(biāo)用于臨床預(yù)測(cè)患者預(yù)后顯得尤為迫切。目前，關(guān)于hsa_circ_0001727在腫瘤中的作用已有初步探索，然而目前未見(jiàn)關(guān)于hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的報(bào)道。因此本研究就hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討。

本實(shí)驗(yàn)比較了肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中hsa_circ_0001727的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織中hsa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，表明hsa_circ_0001727可能參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程。通過(guò)分析hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者臨床病理資料的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者BCLC分期、病灶數(shù)目、分化程度有關(guān)，提示hsa_circ_0001727可能與肝細(xì)胞癌病程發(fā)展存在關(guān)系。通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行為期三年的隨訪，了解到肝細(xì)胞癌患者1～3年的生存率分別為84.75%、75.42%、68.64%，與劉愛(ài)祥等[15-16]研究結(jié)果相似。通過(guò)比較不同預(yù)后患者h(yuǎn)sa_circ_0001727的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)死亡組患者h(yuǎn)sa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量低于生存組患者，提示檢測(cè)hsa_circ_0001727相對(duì)表達(dá)量可能有助于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后情況。因此，筆者構(gòu)建了hsa_circ_0001727預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示hsa_circ_0001727預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的AUC為0.827，表明hsa_circ_0001727預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的效能較高。為明確hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系，筆者采用Cox回歸分析影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的因素，發(fā)現(xiàn)肝動(dòng)脈化療栓塞、hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后密切相關(guān)，結(jié)果與既往研究[17]相符。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hsa_circ_0001727可調(diào)節(jié)生存素的表達(dá)水平[18]。生存素是凋亡抑制因子家族成員，其可參與調(diào)控細(xì)胞的死亡過(guò)程，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程減弱，造成細(xì)胞凋亡減少、增殖活性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤體積增大[19]。此外，生存素還具有抑制半胱氨酸蛋白酶-3的作用，半胱氨酸蛋白酶-3是促凋亡因子激活的重要蛋白酶，其在細(xì)胞早期凋亡中起到關(guān)鍵作用。活化的半胱氨酸蛋白酶-3可特異性降解細(xì)胞蛋白和核糖聚合酶，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA損傷并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。因此筆者推測(cè)hsa_circ_0001727可能通過(guò)調(diào)節(jié)生存素的表達(dá)參與肝細(xì)胞癌的疾病進(jìn)展。

綜上所述，hsa_circ_0001727與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后密切相關(guān)，檢測(cè)hsa_circ_0001727表達(dá)情況有助于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后。本研究仍存在一定不足，下一步將繼續(xù)開(kāi)展基礎(chǔ)研究，分析hsa_circ_0001727影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的病理生理機(jī)制。