花 晴，申雪芳，許平波

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

結(jié)直腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一。近年來，由于化療、免疫治療和靶向治療的飛速發(fā)展，結(jié)直腸癌患者的總生存率顯著提升。但由于其高發(fā)病率，結(jié)直腸癌仍是死亡率較高的惡性腫瘤之一［1-2］。人組織激肽釋放酶相關(guān)肽酶家族（kallikrein-related peptidases，KLKs）由KLK1～KLK15組成，是一組具有胰蛋白酶和糜蛋白酶樣活性的絲氨酸蛋白酶［3-4］。KLKs具有多種生物學(xué)功能，在血液凝固、補體激活、胚胎發(fā)育和傷口愈合等方面具有重要作用［5-7］。作為KLKs家族的重要成員，KLK8是一種突觸相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，可參與多種生物活動如表皮增殖分化、角質(zhì)形成等［8］。近年來，越來越多的研究［6，9］表明，KLK8與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在卵巢癌［10］、宮頸癌［11］和肺癌［12］等多種腫瘤中均異常表達(dá)。與此同時，越來越多的證據(jù)［13-14］證明，KLK8可作為腫瘤生存和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。然而，KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響尚未可知。為進一步探索KLK8促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的機制，本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，通過基因集富集分析法（gene set enrichment analysis，GSEA），對KLK8高表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)直腸癌組織進行基因表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLK8高表達(dá)與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的分解、表皮發(fā)育密切相關(guān)。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）由53個氨基酸殘基組成，編碼基因位于人類染色體4（4q25-27）上，可在多種正常細(xì)胞、人類癌組織中表達(dá)。有研究［15-17］表明，EGF可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。作為一種絲氨酸蛋白酶，KLKs具有水解多種蛋白底物的能力，有研究［18］表明，KLK8可通過剪切激活EGF，促進心肌肥厚。那么，KLK8是否可通過EGF途徑對結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響？本研究將探討KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其機制，為進一步探索KLK8對結(jié)直腸癌的影響及其潛在機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實驗試劑

人胚腎上皮細(xì)胞HEK-293T、人結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和SW480均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，所有細(xì)胞均培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）中，所有培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清（美國Gibco公司）和1%青霉素/鏈霉素（美國Invitrogen公司）。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）siRNA套裝購自百奧生物技術(shù)（南通）有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，KLK8質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，嘌呤霉素購自美國Roche公司，ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，兔抗人KLK8多克隆抗體（貨號：ab150395）購自英國Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體（貨號：sc-47778）購自美國Santa Cruz公司，山羊抗兔IgG二抗（貨號：7076Ⅴ）和山羊抗小鼠IgG二抗（貨號：7074Ⅴ）均購自美國Cell Signaling公司。

1.2 腫瘤基因組圖譜分析與GSEA

GEO芯片數(shù)據(jù)集GSE21815、GSE37182和GSE71187從GEO官網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載，用于比較結(jié)直腸正常組織和癌旁組織間的差異。TCGA結(jié)腸癌（COAD）由275例結(jié)直腸癌和349名健康志愿者組成，從USUC Xena網(wǎng)站（https://xenabrowser.net/datapages/?dataset=TCGA）下載。為闡明KLK8在結(jié)直腸癌中的作用機制，在Broad Institute平臺上進行GSEA，并將統(tǒng)計學(xué)顯著性設(shè)為0.25。利用“GO”基因集的方法，對KLK8高表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)進行基因表達(dá)差異分析，尋找KLK8的相關(guān)信號通路。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒慢病毒包裝

將HEK-293T以1×107個/10 cm培養(yǎng)皿的密度鋪板。次日進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。按照目的質(zhì)粒（pcDNA3.1-KLK8質(zhì)粒，上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）∶包裝質(zhì)粒psPAX2∶包裝質(zhì)粒pMd.2.G為2.0∶1.5∶0.5的比例，將3種質(zhì)?；旌显?00 μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中。按照LipofectamineTM3000產(chǎn)品說明書進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。48 h后收集上清液。收集的病毒液經(jīng)過濾器過濾后于-80 ℃儲存。將RKO和SW480細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的密度放置在6孔板中，培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入上述得到的病毒液。感染24 h后去除病毒液，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。將2 μg/mL嘌呤霉素加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，4周后產(chǎn)生穩(wěn)定的KLK8過表達(dá)細(xì)胞系。收集耐藥細(xì)胞進行后續(xù)分析。

1.3.2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

配制轉(zhuǎn)染反應(yīng)體系：siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例為1 μg∶1 μL，分別用125 μL Opti-MEM溫育于Ependorf試管中，室溫溫育5 min，然后混合。將RKO和SW480細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔的密度鋪板在6孔板中，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，加入上述轉(zhuǎn)染體系，感染24 h后換液，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。收集細(xì)胞進行后續(xù)分析。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

按照十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠的配方制備合適濃度的SDS-PAGE凝膠膠板。將制備好的SDSPAGE膠板安裝好。加入電泳緩沖液后，加入50 μg蛋白樣品到凝膠內(nèi)的上樣孔中，80 Ⅴ電壓電泳，電泳完畢后開始轉(zhuǎn)膜，用甲醇激活聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜，100 Ⅴ轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜完成后，采用5%胎牛血清室溫封閉1 h。加入一抗KLK8（1∶1 000稀釋）、β-actin（1∶5 000稀釋），4 ℃搖床上溫育過夜。第2天用1×磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween，PBST）洗膜5次，每次7 min，加入對應(yīng)一抗種屬來源的HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗均為1∶5 000稀釋），在室溫?fù)u床上溫育1 h，用1×PBST洗膜5次，每次7 min。然后曝光成像。

1.3.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

計數(shù)鋪RKO和SW480細(xì)胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：E606336）說明書處理細(xì)胞，處理好的細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測EGF表達(dá)

收集RKO和SW480的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2 000～3 000 r/min離心20 min。仔細(xì)收集上清液。應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中EGF的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃ 40 min。接著用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。向每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外）。將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃ 20 min。然后用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板置于37℃10 min。接著用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min。每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀（型號：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）在450 nm處測吸光度（D）值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗中所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 13.0軟件進行。實驗中所有的數(shù)據(jù)均以表示，兩個樣本間比較均使用t檢驗，多樣本間用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中KLK8的表達(dá)情況

KLK8的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［10，12］。本研究采用GEO芯片數(shù)據(jù)集GSE21815、GSE37182和GSE71187分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中KLK8的表達(dá)顯著上調(diào)（圖1）。

圖1 KLK8在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高Fig.1 KLK8 is highly expressed in colorectal cancer

2.2 KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡異常是人類惡性腫瘤的特征［19］。本研究通過構(gòu)建KLK8過表達(dá)的RKO和SW480細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和敲低細(xì)胞株來判斷KLK8表達(dá)升高或降低是否會影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，Western blot檢測證實已成功構(gòu)建了KLK8過表達(dá)的RKO和SW480細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和敲低細(xì)胞株（圖2A）。采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)來檢測KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響，與對照組相比，KLK8過表達(dá)顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡（圖2B、C）。

圖2 KLK8過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡Fig.2 KLK8 overexpression inhibited apoptosis of colorectal cancer cells

2.3 GESA分析KLK8表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的機制

為深入了解KLK8抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的機制，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫，采用GSEA對KLK8高表達(dá)和KLK8低表達(dá)結(jié)直腸癌組織中的基因表達(dá)進行了分析。結(jié)果顯示，根據(jù)KLK8表達(dá)水平的不同，142條富集途徑的表達(dá)存在差異，本研究選取差異最明顯的前20條通路（圖3A，P＜0.05）。KLK8與ECM的分解、表皮發(fā)育通路正相關(guān)，這兩種通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)（圖3B）。

圖3 結(jié)直腸癌中KLK8高低表達(dá)顯著富集的通路Fig.3 Significantly-altered pathways were predicted in colorectal cancer depending on KLK8 expression

2.4 KLK8抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的機制

作為一種絲氨酸蛋白酶，KLK8能切割并激活多種膜蛋白的細(xì)胞外部分，如EGF。EGF與表皮發(fā)育、ECM的降解密切相關(guān)［16-17］。在過表達(dá)KLK8的RKO和SW480細(xì)胞上清液中，EGF的表達(dá)明顯升高（圖4A），表明KLK8可以剪切EGF。接下來，本研究探討了EGF的表達(dá)升高是否有助于KLK8在結(jié)直腸細(xì)胞中的抗凋亡功能。在過表達(dá)KLK8的RKO和SW480細(xì)胞中利用siRNA敲低EGFR（圖4B），細(xì)胞凋亡明顯增多（圖4C、D），表明抑制EGFR可以逆轉(zhuǎn)KLK8的抗凋亡作用。

圖4 KLK8通過激活EGF抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡Fig.4 KLK8 inhibited colorectal cancer cell apoptosis via the activation of the EGF

3 討論

結(jié)直腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下。發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，死亡率居第2位［20-21］。因此，迫切需要研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機制和分子生物學(xué)標(biāo)志物，以促進結(jié)直腸癌的早期診斷、預(yù)后預(yù)測和制定有效的治療策略。

KLK8參與腫瘤發(fā)展的多個階段，如腫瘤的增殖、遷移和血管生成，與腫瘤的惡性行為密切相關(guān)［4，9，12］。有研究［22］表明，KLK8可促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響及其機制尚未可知。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，KLK8在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)升高。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)KLK8可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，而敲低KLK8可促進結(jié)直腸癌的凋亡。

KLKs具有水解多種底物的能力，如促表皮生長因子（pro-epidermal growth factor，pro-EGF）、蛋白酶激活受體（protease-activated receptor，PAR）和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1等［18］。本研究通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)，KLK8高表達(dá)與表皮發(fā)育及ECM的分解密切相關(guān)。作為表皮發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，EGF是一種含有53個氨基酸殘基的多肽，可與EGFR結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)信號通路的級聯(lián)反應(yīng)。因此，EGF可參與多種生理學(xué)和病理學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、存活和血管生成等［16-17］。本研究顯示，過表達(dá)KLK8的結(jié)直腸癌細(xì)胞上清液中，EGF的表達(dá)量增多，表明KLK8可剪切結(jié)直腸癌細(xì)胞表面的pro-EGF，釋放EGF。為進一步研究其對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究利用siRNA敲低EGF的細(xì)胞表面受體EGFR，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低EGFR后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡增加，表明抑制EGFR可逆轉(zhuǎn)KLK8抑制的結(jié)直腸細(xì)胞的凋亡，因此推測KLK8可通過剪切釋放EGF，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

本研究顯示，KLK8在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高。過表達(dá)KLK8可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，敲低KLK8可促進細(xì)胞的凋亡。KLK8可剪切釋放EGF，敲低EGFR表達(dá)，阻斷EGF調(diào)控信號通路可逆轉(zhuǎn)KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的抑制作用。本研究闡明了KLK8對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響及其潛在機制，為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供了新線索。