彭子珊，孔 輝，鮑 真，趙紅杏，劉 鑫，盧韶華

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

肺癌是惡性程度較高的腫瘤之一，每年因肺癌死亡人數(shù)約1 600萬(wàn)人［1］。作為一種特殊類(lèi)型的肺癌，多發(fā)肺癌（multifocal lung cancer，MLC）的發(fā)生率為1%～15%［2］。MLC又可分為多原發(fā)肺腺癌（multiple primary lung adenocarcinoma，MPLA）和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移（intrapulmonary metastases，IM），而MPLA和IM的鑒別，對(duì)腫瘤分期及治療有重要意義。1975年，Martini等［3］首次提出MPLA的鑒別標(biāo)準(zhǔn)。隨后，Antakli等［4］在1995年提出了修訂過(guò)的Martini-Melamed標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)在2007年為Martini-Melamed標(biāo)準(zhǔn)增加了臨床評(píng)估和分子分析［5］。本研究回顧性分析83例多發(fā)肺腺癌（multifocal lung adenocarcinoma，MLA）患者的臨床病理學(xué)特征，根據(jù)病理形態(tài)學(xué)特征及基因突變情況來(lái)鑒別MPLA及IM，以提高臨床和病理科醫(yī)師對(duì)MPLA和IM的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2016年1月—2017年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的83例MLA患者進(jìn)行分析。入組患者均有完整的臨床病例資料，包括性別、年齡、吸煙史、手術(shù)方式、腫瘤數(shù)目、腫瘤位置、腫瘤最大徑及生存情況等。TNM分期參考標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版肺癌TNM分期，MLA位于同一肺葉時(shí)為T(mén)3期，MLA位于同側(cè)肺但不同肺葉時(shí)為T(mén)4期，MLA位于對(duì)側(cè)肺葉時(shí)為M1a期。隨訪數(shù)據(jù)通過(guò)查閱病歷系統(tǒng)、電話聯(lián)系等方式獲得。

1.2 MLA雙原發(fā)與轉(zhuǎn)移的鑒別

1.2.1 病理學(xué)分析

所有H-E切片均由兩名獨(dú)立的病理科醫(yī)師閱片，對(duì)肺腺癌亞型（貼壁型、腺泡型、乳頭型、實(shí)體型及微乳頭型等）進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，所占比例最大的亞型認(rèn)為是主要亞型［6］。根據(jù)同一患者的不同腫瘤在石蠟切片上的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，參考Martini-Melamed標(biāo)準(zhǔn)，若多個(gè)病灶均觀察到“貼壁型”到肺腺癌浸潤(rùn)的發(fā)展過(guò)程，則為MPLA；若無(wú)，且主要組織學(xué)亞型、次要組織學(xué)亞型均相似者判斷為IM，主要組織學(xué)亞型、次要組織學(xué)亞型差異較大者判斷為MPLA［7-8］。若有爭(zhēng)議，則兩名醫(yī)師共同討論或?qū)＜視?huì)診后判定。

1.2.2 基因分析

所有患者均行9基因檢測(cè)，具體包括表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因第18、19、20、21外顯子突變、KRAS基因第2外顯子突變、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因融合、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）基因第20外顯子突變、NRAS基因第2、3外顯子突變、BRAF基因第15外顯子突變、ROS1基因融合、RET基因融合、PIK3CA基因第9、20外顯子突變的檢測(cè)。若兩病灶存在1個(gè)及1個(gè)以上相同的基因突變，考慮為IM；若兩病灶存在1個(gè)及1個(gè)以上不同的基因突變，則考慮為MPLA［9］。當(dāng)形態(tài)學(xué)結(jié)論與基因分析結(jié)果不一致時(shí)，以基因分析結(jié)果為準(zhǔn)；當(dāng)兩病灶均無(wú)基因突變時(shí)，采用組織學(xué)分析結(jié)果［8，10］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臨床病理學(xué)特征

83例患者中，男性33例，女性50例。發(fā)病年齡為34～80歲，中位年齡（64.0±8.6）歲。68例患者為雙病灶，14例患者為三病灶，1例患者為四病灶。62例患者有吸煙史。37例患者病灶位于同一肺葉，27例患者病灶位于同側(cè)不同肺葉，19例患者病灶位于對(duì)側(cè)肺葉。所有腫瘤均經(jīng)手術(shù)切除且均為同時(shí)切除（表1）。

表1 83例MLA患者的臨床病理學(xué)特征Tab.1 The clinicopathological features of 83 MLA patients［n (%)］

2.2 MPLA和IM的鑒別診斷

83例MLA患者根據(jù)病理形態(tài)學(xué)特征，50例（60.00%）判斷為MPLA，33例（40.00%）為IM。在50例MPLA中，23例（46.00%）主要組織學(xué)亞型及次要組織學(xué)亞型差異較大，27例（54.00%）患者的多個(gè)病灶均觀察到“貼壁型”到肺腺癌浸潤(rùn)的發(fā)展過(guò)程。1例MLA患者的兩個(gè)病灶的組織學(xué)亞型均以篩狀型為主（圖1A、B），主要組織學(xué)亞型相似，因此組織學(xué)判斷為IM；另1例MLA患者的一個(gè)病灶以乳頭型及微乳頭型為主（圖1C），另一病灶以貼壁型為主，部分為腺泡型（圖1D），主要組織學(xué)亞型及次要組織學(xué)亞型差異較大，因此組織學(xué)判斷為MPLA。

圖1 MPLA和IM患者的組織學(xué)形態(tài)Fig.1 Histological classification of MPLAs and IM patients

基因突變分析結(jié)果顯示，83例MLA患者的182個(gè)病灶中，118個(gè)（68.84%）病灶檢測(cè)出EGFR基因突變，15個(gè)（8.24%）病灶檢測(cè)出KRAS基因突變，7個(gè)（3.85%）病灶檢測(cè)出ALK基因突變，4個(gè)（2.20%）病灶檢測(cè)出PIK3CA基因突變，3個(gè)（1.65%）病灶檢測(cè)出HER2基因突變，2個(gè)（1.10%）病灶檢測(cè)出BRAF基因突變，1個(gè)（0.55%）病灶檢測(cè)出ROS1基因突變，1個(gè)（0.55%）病灶檢測(cè)出RET基因突變，未檢出NRAS基因突變。39例（46.99%）患者的多個(gè)病灶均有1個(gè)及1個(gè)以上相同的基因突變，因此鑒別為IM；其中多個(gè)病灶均發(fā)生EGFR第18外顯子突變?yōu)?例，均發(fā)生EGFR第19外顯子突變?yōu)?2例，均發(fā)生EGFR第20外顯子突變?yōu)?例，均發(fā)生EGFR第21外顯子突變?yōu)?1例，均發(fā)生KRAS基因第2外顯子突變?yōu)?例，均發(fā)生ALK基因融合為1例，均發(fā)生HER2基因第20外顯子突變?yōu)?例。35例（42.17%）患者的多個(gè)病灶存在1個(gè)及1個(gè)以上不同的基因突變，因此鑒別為MPLA。例如，1例66歲女性MLA患者，病灶1檢測(cè)出KRAS基因第2外顯子突變，病灶2檢測(cè)出EGFR第19外顯子突變，基因突變不相同，因此鑒別為MPLA。9例（10.84%）患者未檢測(cè)出任何基因突變，鑒別結(jié)果以病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果為準(zhǔn)。此外，18例（21.69%）患者的病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果與基因分析結(jié)果不一致，最終診斷以基因分析結(jié)果為準(zhǔn)（表2）。其中6例患者形態(tài)學(xué)判斷為IM，但病灶間存在一個(gè)以上差異的基因突變，因此結(jié)合基因分析結(jié)果判斷為MPLA；其中2例病灶位于同一肺葉，3例病灶位于同側(cè)不同肺葉，1例病灶位于對(duì)側(cè)肺葉，并且2例出現(xiàn)復(fù)發(fā)。12例患者形態(tài)學(xué)判斷為MPLA，但病灶間存在一個(gè)以上相同的基因突變，因此結(jié)合基因分析結(jié)果判斷為IM；其中2例病灶位于同一肺葉，7例病灶位于同側(cè)不同肺葉，3例病灶位于對(duì)側(cè)肺葉，并且3例患者死亡，5例出現(xiàn)復(fù)發(fā)。結(jié)合病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果及基因突變分析結(jié)果，最終判斷41例（49.00%）為MPLA，42例（51.00%）為IM。

表2 18例病理形態(tài)學(xué)和基因突變結(jié)果不一致的MLA患者的病理學(xué)和遺傳學(xué)信息Tab.2 Pathologic and genetic information of 18 cases of discordant patients according to histological and gene mutation results

2.3 預(yù)后分析

83例患者的末次隨訪時(shí)間為2021年2月，中位隨訪時(shí)間為46個(gè)月。至末次隨訪時(shí)，22例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，10例死亡，3年OS率為93.98%，3年DFS率為77.11%。MPLA組中，5例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，2例死亡，3年OS率為95.12%，3年DFS率為87.80%。IM組中，17例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，8例死亡，3年OS率為80.95%，3年DFS率為59.52%。

本研究分別比較了病理形態(tài)學(xué)判斷和結(jié)合基因分析判斷兩種情形下MPLA和IM的生存差異。在病理形態(tài)學(xué)判斷的結(jié)果中，IM組患者OS率（圖2A）和DFS率（圖2B）均低于MPLA組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)合基因分析后，MPLA和IM組間患者OS率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2C），但DFS率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，圖2D），鑒別為IM的患者DFS率更差。根據(jù)淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移分組時(shí)，在N0及Nx狀態(tài)下，IM組患者DFS率更差（P=0.016），OS率亦低于MPLA組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在N1及N2狀態(tài)下，IM和MPLA組間患者OS率無(wú)明顯差異，IM組患者的DFS率更差，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。對(duì)OS率和DFS率的單因素分析結(jié)果表明，男性（P=0.009）、淋巴血管侵犯（P=0.011）及EGFR野生型（P＜0.001）是OS率的危險(xiǎn)因素，淋巴管/血管侵犯（P=0.005）及綜合標(biāo)準(zhǔn)鑒別為IM（P=0.004）是DFS率的危險(xiǎn)因素（表3）。對(duì)OS率和DFS率的多因素分析結(jié)果表明，EGFR野生型（P=0.007）是OS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，綜合標(biāo)準(zhǔn)鑒別為IM（P=0.007）是DFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表4）。此外，病理形態(tài)學(xué)分析在單因素和多因素分析中對(duì)患者OS率和DFS率的影響差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明病理形態(tài)學(xué)是鑒別診斷MPLA和IM的重要手段，基因檢測(cè)可作為重要的補(bǔ)充鑒別手段。

圖2 病理形態(tài)學(xué)鑒別MPLA和IM的OS率（A）、DFS率（B）生存曲線圖，病理形態(tài)學(xué)結(jié)合基因突變分析鑒別MPLA和IM的OS率（C）、DFS率（D）生存曲線圖Fig.2 OS rate (A) and DFS rate (B) curves of patients with MPLA and IM diagnosed by histological analysis,OS rate (C) and DFS rate (D)curves of patients with MPLA and IM diagnosed by histological and gene mutation analysis

圖3 綜合鑒別MLC患者N0和Nx狀態(tài)下MPLA和IM的OS率（A）、DFS率（B）生存曲線圖，以及N1和N2狀態(tài)下MPLA和IM的OS率（C）、DFS率（D）生存曲線圖Fig.3 OS rate (A) and DFS rate (B) curves of N0 and Nx patients and OS rate (C) and DFS rate (D) curves of N1 and N2 patients with MPLA and IM diagnosed by histological and gene mutation analysis

表3 影響83例MLA患者預(yù)后的單因素分析Tab.3 Univariate analyses of prognostic factors in 83 MLA patients

續(xù)表 3

表4 影響83例MLA患者預(yù)后的多因素分析Tab.4 Multivariate analyses of prognostic factors in 83 MLA patients

3 討論

1975年，Martini等［3］首次提出根據(jù)腫瘤部位及組織學(xué)類(lèi)型來(lái)診斷MPLA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Martini-Melamed標(biāo)準(zhǔn)至今仍然被廣泛使用，隨后亦有多次修訂，著重增加了腫瘤分子遺傳學(xué)特征，同時(shí)兼顧多原發(fā)和轉(zhuǎn)移的鑒別診斷［4-5，11］。但目前為止尚無(wú)明確的MPLA和IM的鑒別診斷標(biāo)準(zhǔn)。

Girard等［7］研究發(fā)現(xiàn)，全面的病理組織學(xué)分類(lèi)分析方法可有效地鑒別診斷MPLA和IM。Sun等［12］研究發(fā)現(xiàn)，病灶含貼壁成分通常鑒別為原發(fā)病灶，該研究利用貼壁成分及全面的病理組織學(xué)分類(lèi)對(duì)54例患者的116個(gè)病灶進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)多原發(fā)組的患者預(yù)后較好，表明差異較大的組織學(xué)亞型、貼壁成分為鑒別MPLA和IM的可靠依據(jù)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，比較基因組雜交、微衛(wèi)星分析及二代測(cè)序等在MLC的鑒別中發(fā)揮著重要作用。有研究［13］將具有相似分子生物學(xué)特征的病灶鑒別為IM，差異較大者鑒別為MPLA。Chang等［14］采用EGFR、TP53突變分析對(duì)58例多發(fā)非小細(xì)胞肺癌患者鑒別MPLA和IM，結(jié)果顯示，28例為MPLA，22例為IM，8例無(wú)法鑒別。此外，Girard等［15］通過(guò)分析EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA和TP53的突變狀態(tài)也有助于鑒別MPLA和IM。但采用多種方法鑒別MPLA和IM時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)部分病例基因分析與病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果存在差異。Murphy等［16］使用Martini-Melamed標(biāo)準(zhǔn)、二代測(cè)序?qū)?7例MPLA患者的76個(gè)病灶進(jìn)行分析，其中有9例組織學(xué)診斷結(jié)果與二代測(cè)序基因分析結(jié)果差異明顯。Chang等［8］利用病理組織學(xué)評(píng)估、二代測(cè)序進(jìn)行MLC的鑒別，發(fā)現(xiàn)22%的病理組織學(xué)評(píng)估和二代測(cè)序結(jié)果不一致。此外，Nicholson等［17］闡述了綜合病理學(xué)分析對(duì)MLA的鑒別意義，包括病理學(xué)亞型、細(xì)胞大小、核分裂象及壞死等。但眾多研究一致發(fā)現(xiàn)，病理學(xué)形態(tài)判讀具有主觀性，即使資深的病理專(zhuān)科醫(yī)師，病理學(xué)判讀結(jié)果仍存在不一致性。而基因分析在MLC的鑒別中同樣具有局限性，如原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤間存在異質(zhì)性，病灶之間突變的相似性，并不表明確定的克隆關(guān)系［8］。上述研究表明，鑒別診斷MPLA和IM，需結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及基因分析進(jìn)行綜合判斷。本研究的83例患者中9例未檢測(cè)出任何基因突變，鑒別結(jié)果以病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果為準(zhǔn)；18例患者的病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果與基因分析結(jié)果存在差異，最終診斷以基因分析結(jié)果為準(zhǔn)。

在預(yù)后分析中，本研究通過(guò)比較單獨(dú)病理形態(tài)學(xué)判斷和結(jié)合基因分析判斷的兩種情形下MPLA和IM患者的生存差異，進(jìn)而比較兩種方法對(duì)預(yù)后的指導(dǎo)意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若單獨(dú)通過(guò)病理形態(tài)學(xué)判斷，MPLA和IM組間OS率和DFS率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但結(jié)合基因分析后，MPLA和IM組間DFS率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，COX危險(xiǎn)因素分析顯示，單獨(dú)病理形態(tài)學(xué)鑒別MPLA和IM并非OS率和DFS率的危險(xiǎn)因素，但結(jié)合基因分析綜合鑒別MPLA和IM是患者DFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示基因檢測(cè)可作為兩者鑒別的輔助方法以提高診斷效率，且對(duì)患者預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

文獻(xiàn)［8-9，14，18-25］提示，MLC中MPLA的比例為36%～88%，IM的比例為12%～64%。本研究依據(jù)病理組織學(xué)分析結(jié)果，60%的患者鑒別為MPLA，40%為IM。結(jié)合基因分析后，49%的患者鑒別為MPLA，51%為IM，與以往研究中的比例類(lèi)似。此外，IM與多個(gè)病灶內(nèi)均有微乳頭成分［8］、KRAS野生型［6］、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［6，23］、吸煙［6，8，23］、腫瘤位置［6，9］等密切相關(guān)。多數(shù)研究［18，22，25-26］發(fā)現(xiàn)，MLC中診斷為IM的患者預(yù)后更差；但少數(shù)研究［6，27］發(fā)現(xiàn)，IM和MPLA的鑒別診斷對(duì)患者預(yù)后無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果顯示，IM和MPLA的鑒別診斷對(duì)患者的OS率無(wú)顯著影響，但對(duì)患者的DFS率影響顯著。MLA患者若診斷為IM，術(shù)后更易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。且若無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，IM患者更易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，表明MPLA和IM的鑒別診斷在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中尤為重要。此外，對(duì)OS率和DFS率進(jìn)行單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，綜合標(biāo)準(zhǔn)鑒別MPLA和IM與患者的OS率無(wú)關(guān)，但為DFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜上，MLA患者術(shù)后準(zhǔn)確檢測(cè)EGFR狀態(tài)對(duì)患者的OS率非常重要，綜合病理組織學(xué)分析結(jié)果及基因分析結(jié)果鑒別診斷MPLA和IM對(duì)患者的DFS率非常重要。

隨著高分辨計(jì)算機(jī)斷層掃描（high-resolution computed tomography，HRCT）的普及，多發(fā)磨玻璃影（ground-glass opacity，GGO）結(jié)節(jié)的檢出率逐步提高［28］。研究［29-30］發(fā)現(xiàn)，HRCT表現(xiàn)為GGO的MLC病灶轉(zhuǎn)移傾向很小。Hattori等［31］報(bào)道，在多發(fā)GGO結(jié)節(jié)的患者中，未切除的＜10 mm的純GGO結(jié)節(jié)對(duì)患者的OS率無(wú)顯著影響，定期隨訪即可。然而，Li等［32］通過(guò)對(duì)多發(fā)GGO結(jié)節(jié)進(jìn)行二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，肺內(nèi)的純GGO結(jié)節(jié)也會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。具有部分實(shí)性成分的GGO結(jié)節(jié)由于侵襲性更強(qiáng)，因此不論大小，均應(yīng)選擇手術(shù)切除［33］。Hattori等［34］報(bào)道，在MLC患者中，所有病灶均為實(shí)性結(jié)節(jié)、病灶同時(shí)有實(shí)性結(jié)節(jié)和混合GGO結(jié)節(jié)與病灶均為純GGO結(jié)節(jié)相比，5年OS率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中所有病灶均為實(shí)性結(jié)節(jié)的患者預(yù)后最差，病灶均為純GGO預(yù)后最好。此外，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多發(fā)GGO結(jié)節(jié)患者，亞肺葉切除術(shù)的5年OS率與肺葉切除術(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［31］。

目前，MLC的鑒別診斷方法有多種，包括病理形態(tài)學(xué)分析、克隆分析、多個(gè)基因組合檢測(cè)熱點(diǎn)基因突變、全外顯子測(cè)序及全基因組測(cè)序，但由于部分分子檢測(cè)費(fèi)用較大，目前尚不能普及應(yīng)用，因此病理組織學(xué)特征仍是鑒別診斷MPLA和IM的重要手段，分子檢測(cè)可作為鑒別的輔助方法以提高診斷準(zhǔn)確率。本研究預(yù)后分析顯示，診斷為IM的MLA患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高，需定期復(fù)查和及時(shí)治療。綜上，MPLA和IM的鑒別診斷具有重要的臨床意義，仍需要探索更可靠的鑒別診斷方法，為臨床精準(zhǔn)治療及預(yù)后判斷提供可靠依據(jù)。