肖 鋒，肖靜文，邵建國，陳麗燕，顧春燕

1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，南通市第三人民醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226006；2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，南通市第三人民醫(yī)院消化科，江蘇 南通 226006

目前原發(fā)性肝癌是中國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴(yán)重威脅中國人民的生命健康［1］。肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的組織學(xué)類型。研究表明，HCC患者在腫瘤生長的免疫監(jiān)測中常發(fā)現(xiàn)功能缺陷，其中的機(jī)制包括部分抗原掩蔽、抗原處理失敗、效應(yīng)細(xì)胞抑制和協(xié)同刺激不足［2］。

程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）是一種共抑制受體分子，在活化的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，在調(diào)節(jié)外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用［3-4］。程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）在樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和實質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。有證據(jù)［5］表明，PD-L1可通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡、失能、無應(yīng)答和功能衰竭，向表達(dá)PD-1的T淋巴細(xì)胞傳遞抑制信號，從而抑制免疫應(yīng)答，因此PD-1/PD-L1在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，HCC腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)狀態(tài)與腫瘤免疫主要效應(yīng)細(xì)胞CD8+T淋巴細(xì)胞的關(guān)系尚不清楚，通過PD-1/PD-L1途徑發(fā)揮免疫抑制作用的CD8+T淋巴細(xì)胞功能的變化仍有待闡明。因此，本研究旨在探討PD-1在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)狀態(tài)與HCC臨床病理學(xué)參數(shù)、PD-L1的表達(dá)、CD8+T淋巴細(xì)胞之間的相關(guān)性及與患者預(yù)后的相關(guān)性，采用免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記法檢測CD8+PD-1+雙陽性T淋巴細(xì)胞密度對HCC患者預(yù)后的影響，旨在為HCC治療提供一個潛在的免疫調(diào)節(jié)靶點。

1 資料和方法

1.1 病例資料

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①2008年1月—2016年12月于南通市第三人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的所有HCC患者；② 經(jīng)病理學(xué)檢查證實為HCC；③術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；④ 有完整的臨床及隨訪資料；⑤ 患者簽署知情同意書；⑥ 通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)性HCC；② 術(shù)前接受介入、化療等抗腫瘤治療的患者。共入組344例患者，其中男性271例，女性73例。平均年齡55.3歲。乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）陽性278例。有肝硬化289例。隨訪時間為8～114個月。

1.2 組織芯片的制備

組織芯片的制備由上海芯超生物科技有限公司協(xié)助完成。步驟為：對納入病例的H-E染色病理切片重新閱片，標(biāo)記H-E染色病理切片及對應(yīng)蠟塊上的代表性位置。用打孔儀在樣本蠟塊上打孔、細(xì)針吸取組織，按照排列順序裝載在芯片蠟塊中。每例樣本均設(shè)置3個復(fù)點。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測

抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)法，在乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（pH=9.0）中消化3 min；之后將樣本與H2O2一起溫育15 min。采用EnⅤision免疫組織化學(xué)染色法：一抗分別為小鼠抗PD-1單克隆抗體（1∶100，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、兔抗PD-L1單克隆抗體［1∶50，基因科技（上海）股份有限公司］和兔抗CD8單克隆抗體（1∶100，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫溫育2 h，然后用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（德國Leica公司）室溫溫育30 min，最后用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。

免疫組織化學(xué)雙染色法：按稀釋比例同時加入小鼠抗PD-1抗體和兔抗CD8抗體兩種一抗，室溫溫育2 h后，滴加堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記山羊抗小鼠二抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗兩種二抗，室溫溫育30 min；用GBI-久紅顯色5 min、沖洗，隨后DAB顯色5 min。用蘇木精復(fù)染。

1.4 結(jié)果判定

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-1的存在表現(xiàn)為為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色：依據(jù)參考文獻(xiàn)［6］的方法，用組織芯片計數(shù)PD-1+淋巴細(xì)胞數(shù)量，然后根據(jù)PD-1+細(xì)胞計數(shù)，大于中位數(shù)判為高表達(dá)組，小于等于中位數(shù)判為低表達(dá)組。

腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1通過評估染色細(xì)胞的百分比（PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)/所有腫瘤細(xì)胞數(shù)或PD-L1陽性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)/所有腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)）來量化。當(dāng)≥1%的腫瘤細(xì)胞中PD-L1呈陽性反應(yīng)時，腫瘤細(xì)胞被判定為PD-L1陽性表達(dá)，判斷標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)部分或完全染色。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色陽性細(xì)胞數(shù)≥1%［7］。

腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞密度、CD8+PD-1+雙陽性T淋巴細(xì)胞密度判定：計數(shù)組織芯片各點CD8+淋巴細(xì)胞、CD8+PD-1+雙陽性細(xì)胞數(shù)量，計算免疫反應(yīng)細(xì)胞的平均計數(shù)，大于平均計數(shù)判為高密度組，小于等于平均計數(shù)判為低密度組。

結(jié)果由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法評估，可疑病例由兩名醫(yī)師使用多頭顯微鏡討論，直到達(dá)成共識。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。PD-1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)等之間的相關(guān)性用χ2檢驗評價。采用Kaplan-Meier法計算總生存率并繪制生存曲線，組間比較用log-rank檢驗。采用單因素和多因素COX回歸分析判斷是否為獨(dú)立預(yù)后因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1在HCC腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

免疫組織化學(xué)染色顯示，PD-1表達(dá)于HCC腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中（圖1），腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-1的陽性率為43.9%（151/344）。PD-1高表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級有關(guān)（P=0.009，表1），與年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、有無肝硬化及微血管侵犯等臨床病理學(xué)參數(shù)無明顯相關(guān)性。

2.2 PD-1在HCC腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的表達(dá)與PD-L1表達(dá)、腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞密度的關(guān)系

腫瘤細(xì)胞中PD-L1的陽性率為21.8%（75/344），腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1的陽性率為47.1%（162/344），腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞高密度率為45.3%（156/344）。PD-1高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)（P＜0.001）、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)（P＜0.001）及腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞密度相關(guān)（P=0.003，圖1，表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法標(biāo)記PD-1、PD-L1和CD8的表達(dá)情況Fig.1 Expressions of PD-1,PD-L1 and CD8 detected by immunohistochemistry

表1 PD-1的表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)參數(shù)、PD-L1表達(dá)及腫瘤浸潤C(jī)D8+ T淋巴細(xì)胞的關(guān)系Tab.1 Relationship between PD-1 expression and clinicopathological parameters,PD-L1 expression and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes in HCC patients(n)

續(xù)表 1

2.3 PD-1高表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，PD-1高表達(dá)組HCC患者的OS和DFS較PD-1低表達(dá)組明顯降低（P均＜0.001）。單因素COX回歸分析顯示，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-1高表達(dá)是OS和DFS的不良預(yù)后因子（OS：HR=2.344，P＜0.001；DFS：HR=2.750，P＜0.001），腫瘤＞3 cm、組織學(xué)分級高、有微血管侵犯及腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)是OS和DFS的不良預(yù)后因子，并且低密度腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞是DFS的不良預(yù)后因子。為評估可能存在的混雜變量，對單變量COX比例風(fēng)險分析中達(dá)到顯著性的因素，以及具有臨床意義的指標(biāo)HBsAg、肝硬化等因素采用多變量COX回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-1高表達(dá)是OS和DFS的獨(dú)立不良預(yù)后因子（OS：HR=1.654，P=0.010；DFS：HR=2.518，P＜0.001，圖2，表2～3）。

圖2 PD-1的表達(dá)水平對HCC患者預(yù)后的預(yù)測價值Fig.2 The prognostic value of PD-1 expression in HCC patients

表2 單因素和多因素COX回歸分析OS預(yù)測因子Tab.2 Univariate and multivariate COX regression analyses of OS predictors

表3 單因素和多因素COX回歸分析DFS預(yù)測因子Tab.3 Univariate and multivariate COX regression analyses of DFS predictors

2.4 腫瘤浸潤C(jī)D8+ PD-1+雙陽性T淋巴細(xì)胞密度對HCC預(yù)后的影響

腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞對腫瘤患者生存的影響一直備受關(guān)注。有研究表明，腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞密度與多種實體瘤類型的良好預(yù)后相關(guān)［8-9］，也與化療和免疫治療反應(yīng)的改善相關(guān)［10］。本研究數(shù)據(jù)顯示，高密度腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞組DFS較低密度組明顯改善（P＜0.001），并且OS亦優(yōu)于低密度組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步對高密度腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞組HCC患者用免疫組織化學(xué)雙染色法檢測CD8+PD-1+雙陽性腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的密度，結(jié)果顯示，高密度CD8+PD-1+T淋巴細(xì)胞組較低密度組OS和DFS更差（P均＜0.001，圖3～4）。

圖3 免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記CD8（棕色）、PD-1（紅色）染色Fig.3 Immunohistochemical double labeled CD8 (brown) and PD-1 (red) staining

圖4 CD8+ PD-1+雙陽性T淋巴細(xì)胞密度對HCC患者預(yù)后的預(yù)測價值Fig.4 The prognostic value of CD8+ PD-1+ double expression T lymphocyte density in HCC patients

3 討論

本研究檢測了HCC患者腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PD-1高表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)及腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞密度有關(guān)，同時PD-1高表達(dá)是OS和DFS的不良預(yù)后因子。此外，腫瘤浸潤C(jī)D8+PD-1+T淋巴細(xì)胞的增加可以預(yù)測疾病進(jìn)展和術(shù)后復(fù)發(fā)。

HCC通常是在慢性肝?。砸倚透窝谆虮透窝撞《靖腥尽⒋x紊亂或慢性乙醇性肝損害）的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，因其促進(jìn)了肝臟的免疫抑制狀態(tài)和T淋巴細(xì)胞功能衰竭［11］。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，肝臟微環(huán)境中有效的抗腫瘤免疫監(jiān)視功能受損，免疫檢查點尤其是PD-1/PD-L1信號通路參與了這一過程［12］。

有研究［13］顯示，在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中，高密度腫瘤浸潤PD-1+T淋巴細(xì)胞組比低密度組有更高的腫瘤識別能力和明顯不同的預(yù)后，其中高密度PD-1+T淋巴細(xì)胞能預(yù)測患者的治療反應(yīng)和存活率。在HCC患者中，PD-1在CD8+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)增加與術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)［14］；在未經(jīng)免疫治療的HCC患者中，循環(huán)和腫瘤浸潤C(jī)D8+PD-1+T淋巴細(xì)胞的密度增加與肝切除術(shù)后的進(jìn)展相關(guān)［15］，這與本研究結(jié)論一致。同時，表達(dá)PD-1的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的數(shù)量被證明可以預(yù)測PD-1阻斷后的臨床治療效果［16］，并且腫瘤對PD-1阻斷的反應(yīng)取決于預(yù)先存在的CD8+T淋巴細(xì)胞的狀態(tài)，這些細(xì)胞受到PD-1/PD-L1介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫抵抗的負(fù)調(diào)節(jié)［17］。

對于HCC患者中PD-1/PD-L1通路在CD8+T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的作用機(jī)制尚不清楚。有研究［18-19］顯示，HCC腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞中PD-1不同表達(dá)水平的亞群具有不同的基因表達(dá)模式，高表達(dá)PD-1的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群具有高水平的調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞衰竭的基因模式，其通過產(chǎn)生低濃度的γ-干擾素和腫瘤壞死因子發(fā)揮功能，用抗PD-1的抗體溫育該亞群細(xì)胞可部分恢復(fù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因而具有高表達(dá)PD-1的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的HCC患者可能對于免疫檢查點阻斷劑的聯(lián)合治療效果更為明顯，同時，PD-L1在HCC中的表達(dá)可抑制T淋巴細(xì)胞在微環(huán)境中的功能，本研究顯示，腫瘤細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)為HCC患者復(fù)發(fā)的預(yù)測因子，這與之前的研究結(jié)論［20］一致。對HCC切除術(shù)后標(biāo)本的分析顯示，PD-L1高表達(dá)與未進(jìn)一步接受過免疫治療的患者的腫瘤侵襲性和預(yù)后不良有關(guān)［21］。

綜上所述，PD-1在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中顯著上調(diào)，尤其是在效應(yīng)CD8+T淋巴細(xì)胞中。這種PD-1表達(dá)的增加可能是HCC患者預(yù)后不良的原因。進(jìn)一步通過多變量分析來證實PD-1+和CD8+PD-1+免疫浸潤T淋巴細(xì)胞的預(yù)后價值，并強(qiáng)調(diào)與HCC腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的顯著相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)拓展了我們對HCC患者抗腫瘤反應(yīng)過程中HCC細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞間PD-1/PD-L1相互作用的認(rèn)識。