臧真鳳，白婕，劉叢，昝看卓，龍明秀，何樹斌

（西北農(nóng)林科技大學(xué)草原與草業(yè)學(xué)院，陜西楊凌712100）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值豐富、適口性好、消化率高、經(jīng)濟價值高并且抗逆性較強的豆科牧草，素有“牧草之王”的美譽［1-2］。近些年來，在國家振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動及“糧改飼”等產(chǎn)業(yè)政策的帶動下，我國紫花苜蓿種植面積增長速度較快。據(jù)不完全統(tǒng)計，僅2019年全國新增苜蓿種植面積8×1014m2，主要集中在我國西北地區(qū)的甘肅河西走廊、內(nèi)蒙古阿魯科爾沁、寧夏河套灌區(qū)等［3］。水資源短缺是限制紫花苜蓿生長和分布的最重要因素之一［4］。研究表明，干旱脅迫下，紫花苜蓿含水量降低［5］、葉綠素含量減少［6］、光合氣體交換能力下降［7-8］、碳（carbon，C）、氮（nitrogen，N）代謝活性降低［9］、產(chǎn)量和營養(yǎng)價值減少［10］。為了適應(yīng)干旱脅迫，紫花苜蓿通常會調(diào)整植物形態(tài)學(xué)特征、生物量分配和器官C/N計量特征模式［11-12］，啟動滲透調(diào)節(jié)和抗氧化機制等提高其自身抗旱性［13-14］。

植物在適應(yīng)環(huán)境變化的規(guī)律方面存在一定的特異性［13］。研究表明，紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的生物量分配策略、滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化酶機制等都具有品種特異性規(guī)律［15］，也就是說不同紫花苜蓿品種對干旱脅迫的響應(yīng)在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面存在差異。然而，在生產(chǎn)中有關(guān)苜蓿品種特異性的研究相對較少。根系是紫花苜蓿獲取營養(yǎng)、貯藏物質(zhì)和感知土壤中的水分狀態(tài)的主要器官［16-17］，在適應(yīng)干旱脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)紫花苜蓿適應(yīng)干旱脅迫的品種特異性研究多側(cè)重于地上部分，而對葉片和根系協(xié)同響應(yīng)干旱脅迫的品種特異性研究相對較少。因此，本研究選用我國北方地區(qū)紫花苜蓿生產(chǎn)中推廣范圍較廣的WL 363HQ和巨能7紫花苜蓿品種，在溫室內(nèi)模擬干旱脅迫，通過分析株高、分枝數(shù)、生物量、葉片和根系中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸、抗氧化酶類物質(zhì)、C、N、C/N、穩(wěn)定性C同位素（δ13C）和穩(wěn)定性N同位素（δ15N）等，旨在明確供試品種在葉片和根系水平上響應(yīng)干旱脅迫的形態(tài)和抗逆生理方面的品種特異性規(guī)律。研究結(jié)果將為進一步掌握紫花苜蓿葉片和根系協(xié)同抗旱機制及抗旱豐產(chǎn)紫花苜蓿新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設(shè)計

供試紫花苜蓿品種WL 363HQ和巨能7來源于北京克勞沃種業(yè)有限公司。試驗于2020年4-9月在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院智能溫室中完成。選取大小均勻、顆粒飽滿健康的紫花苜蓿種子，用75%酒精溶液浸泡消毒5 min，蒸餾水沖洗5～6次后，放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中，浸潤后置于溫度25℃/18℃（白天/黑夜），14 h/10 h（光/暗）、相對濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱中。發(fā)芽7 d后，選取生長均一且完整的幼苗移栽到裝有1.5 kg取自田間耕作層土壤的花盆中（盆口直徑為12 cm，底直徑為7 cm，高為19 cm）。每花盆移栽一株植物，裝盆前土壤預(yù)先過篩，土壤主要營養(yǎng)成分如下：C（13.5 g·kg-1）、全N（1.26 g·kg-1）、全磷（0.8 g·kg-1）、有效鉀（8.29 mg·kg-1）、鈣（92.85 mg·kg-1）、鈉（138.39 mg·kg-1）。移栽80 d后，選取健康、長勢均一的植株采用稱重法進行干旱脅迫。試驗設(shè)正常水分70%±5%（對照）和干旱脅迫35%±5%（干旱）兩個水分梯度。通過稱重法每隔2 d用蒸餾水補充植物蒸騰失去的水分，使其處于不同的水分梯度下。本試驗共有4個處理，每個處理20盆植物，共計80盆紫花苜蓿。干旱脅迫處理28 d后，分別采集紫花苜蓿的葉片和根系測定各項指標(biāo)。

1.2 試驗指標(biāo)與方法

用直尺測定紫花苜蓿從莖基部到植株頂端的株高，并在莖基部計數(shù)其分枝數(shù)；將收獲的紫花苜蓿沖洗干凈后，再用吸水紙擦去多余水分，分別稱取地上部分和根系的鮮重，再將其置于105℃的烘箱中殺青10 min，之后在80℃將植物烘干至恒重后稱取干重，將植物的地下部分干重與其地上部分干重相比獲得根冠比；采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量［18］；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量［19］；采用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［20］；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［21］。葉片和根系C、N含量及δ13C和δ15N在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所分析測試中心采用ATC-185穩(wěn)定性同位素質(zhì)譜儀測定；C/N為植物組織中全C、N含量的質(zhì)量比。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析（two-way ANOVA），并利用Origin 2020b進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對2個供試品種生長指標(biāo)的影響

干旱脅迫下，WL 363HQ和巨能7之間的株高差異顯著（P＜0.05）（圖1）。干旱脅迫顯著降低了巨能7的株高（P＜0.05），但WL 363HQ的株高在干旱脅迫下與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。WL 363HQ和巨能7分枝數(shù)之間對干旱脅迫的響應(yīng)不同，與對照相比，干旱脅迫處理下WL 363HQ的分枝數(shù)顯著降低（P＜0.05），而巨能7分枝數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7的株高和分枝數(shù)Fig.1 Plant height and br anch number of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought str ess

在對照和干旱脅迫下，WL 363HQ地上部分鮮重和干重均高于巨能7（表1）。相比對照，巨能7地上部分的鮮重和干重在干旱脅迫下顯著降低（P＜0.05）。WL 363HQ根系干重和鮮重在干旱脅迫處理下顯著降低（P＜0.05），但巨能7根系鮮重和干重與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。巨能7品種的根冠比在干旱脅迫下顯著增加（P＜0.05），而WL 363HQ的根冠比在干旱脅迫下減小，但差異不顯著（P＞0.05）。

表1 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7的生物量分配規(guī)律Table 1 Biomass allocation of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.2 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系MDA含量的影響

在對照和干旱脅迫下，WL 363HQ葉片和根系中的MDA含量均高于巨能7，且根系中MDA含量均高于葉片。干旱脅迫顯著提高巨能7葉片中MDA的含量34.30%（P＜0.05），也顯著增加WL 363HQ根系中的MDA含量24.50%（P＜0.05）（圖2）。

圖2 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的MDA含量Fig.2 MDA content in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.3 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中脯氨酸含量的影響

WL 363HQ和巨能7葉片和根系中脯氨酸的含量在干旱脅迫下均有增加，尤其是干旱脅迫顯著提高WL 363HQ葉片中脯氨酸的含量（P＜0.05），比對照提高了69.95%；干旱脅迫也顯著提高巨能7根系中脯氨酸的含量（P＜0.05），比對照提高了120.78%，且巨能7根系中的脯氨酸含量均高于WL363HQ根系脯氨酸的含量（圖3）。

圖3 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的脯氨酸含量Fig.3 Free proline content in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.4 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中SOD和POD活性的影響

在干旱脅迫下，WL363HQ根系中SOD活性顯著高于巨能7根系中SOD活性（P＜0.05）（圖4）。與對照相比，WL 363HQ和巨能7葉片中SOD活性在干旱脅迫時分別增加了21.52%和72.16%，且差異顯著（P＜0.05）。WL 363HQ根系中SOD活性在干旱脅迫下顯著增加（P＜0.05），與對照相比增加了75.64%；而干旱脅迫下根系中POD的活性與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。干旱脅迫顯著提高了巨能7根系中POD活性（P＜0.05），比對照提高了135.74%。在對照和干旱脅迫下，葉片中SOD和POD活性分別高于根系中SOD和POD的活性。

圖4 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的SOD和POD活性Fig.4 SOD and POD activity in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.5 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中C和N含量的影響

在對照處理下，WL 363HQ和巨能7之間的C含量差異不顯著（P＞0.05）（圖5）。干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系的C、N含量，與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。對照處理下，WL 363HQ和巨能7葉片之間C/N差異不顯著（P＞0.05），而在根系中，WL 363HQ的C/N顯著高于巨能7（P＜0.05）。干旱脅迫顯著增加巨能7葉片和根系中C/N（P＜0.05），而WL 363HQ紫花苜蓿葉片和根系內(nèi)C/N在干旱脅迫下差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的C和N含量Fig.5 Carbon and nitr ogen content in leaf and r oot of WL 363HQ and M agnumⅦunder dr ought str ess

2.6 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中δ13C和δ15N的影響

在對照和干旱脅迫下，WL363HQ和巨能7葉片δ13C差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。干旱脅迫顯著增加了巨能7葉片內(nèi)的δ13C（P＜0.05），干旱脅迫也顯著增加了WL 363HQ和巨能7根系中δ13C（P＜0.05），分別比對照提高了8.85%和4.61%。在對照和干旱脅迫下，WL363HQ和巨能7葉片中的δ15N差異顯著（P＜0.05），并且WL363HQ葉片δ15N顯著高于巨能7（P＜0.05），而WL363HQ和巨能7根系內(nèi)的δ15N差異不顯著（P＞0.05）。WL 363HQ和巨能7葉片和根系中δ15N均受干旱脅迫而下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的δ13C和δ15NFig.6δ13C andδ15N values in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

3 討論

紫花苜蓿調(diào)整生物量分配策略是其適應(yīng)干旱脅迫的重要機制之一［22］紫花苜蓿地上生物量和根系生物量，這個結(jié)果與其他有關(guān)紫花苜蓿干旱脅迫的研究結(jié)果一致［7，23］。干旱脅迫下紫花苜蓿氣孔關(guān)閉［8］，光合氣體交換能力下降，葉面積縮?。?］是其生物量降低的主要原因之一。紫花苜蓿分枝數(shù)與其生物量大小相關(guān)，是抗旱評價的重要指標(biāo)之一［24］。WL 363HQ和巨能7紫花苜蓿分枝數(shù)在干旱脅迫下顯著減少，這與其他研究結(jié)果也一致［25-26］。本研究中WL 363HQ和巨能7根系生物量對干旱脅迫的響應(yīng)較為明顯，這與干旱脅迫對紫花苜蓿根系生物量的影響較小的研究結(jié)論相反［22］，這說明紫花苜蓿根系對干旱脅迫的響應(yīng)受供試紫花苜蓿品種、脅迫程度和處理時間等因素的影響［7］。干旱脅迫下多年生草本植物向根系分配更多的生物量，增加其根冠比，以獲取更多限制性的營養(yǎng)物質(zhì)，這是其適應(yīng)干旱脅迫的重要機制之一［12］。本研究中干旱脅迫增加了巨能7的根冠比，但降低了WL 363HQ的根冠比，這意味著植物在適應(yīng)環(huán)境變化的規(guī)律方面存在一定的特異性［13］，不同紫花苜蓿品種在響應(yīng)干旱脅迫的生物量分配策略等方面具有品種特異性［15］。

MDA是植物細(xì)胞膜系被氧化的產(chǎn)物，是植物受到逆境脅迫的標(biāo)志［27］。滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶清除機制是紫花苜蓿適應(yīng)干旱脅迫的重要機制，可調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的水勢，減小干旱對細(xì)胞的影響［10］。本研究中，干旱脅迫下供試品種葉片和根系MDA和脯氨酸含量及抗氧化酶活性較對照均升高，這與國內(nèi)外其他相關(guān)研究的結(jié)果是一致的［7，15，28］。然而，供試品種的葉片和根系MDA和脯氨酸的含量及抗氧化酶類物質(zhì)的活性，在器官水平也具有品種特異性規(guī)律，這可能是葉片和根系所處的地上和地下環(huán)境的差異，導(dǎo)致其物理、化學(xué)屬性以及在時間和空間上資源獲取策略的不同形成的［29］。WL363HQ葉片MDA含量相對較少，說明光合同化器官受到干旱損傷相對較低，且葉片和根系對干旱脅迫具有相對較強的滲透調(diào)節(jié)和抗氧化協(xié)同機制，推測這可能是WL363HQ在對照和干旱脅迫下生物量相對較高的重要原因，也說明滲透調(diào)節(jié)機制和活性氧清除機制是紫花苜蓿在抗旱脅迫下的重要響應(yīng)機制［7］。

紫花苜蓿葉片和根系中C、N代謝對干旱脅迫的響應(yīng)較為敏感，干旱脅迫往往降低了紫花苜蓿葉片和根系中C、N代謝［9］。本研究中干旱脅迫并沒有顯著降低供試品種葉片和根系中C、N含量，這可能是由于豆科牧草中根系貯藏的C、N營養(yǎng)物質(zhì)較多，干旱脅迫下貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)運，調(diào)整了C、N營養(yǎng)物質(zhì)的同化和需求能力［30］。此外，不同研究中選取的紫花苜蓿品種、固氮菌屬性、干旱脅迫時間等不同都會導(dǎo)致研究結(jié)果之間的差異。盡管植物體內(nèi)N濃度在一定程度上決定了生物量大小，本研究中干旱脅迫下供試品種N含量雖然沒有顯著變化，但生物量卻顯著減低，這是由于紫花苜蓿在干旱脅迫下的生長不僅取決于N的吸收，而且取決于N在器官中的分配規(guī)律及結(jié)構(gòu)組織和光合組織中的分布策略等［23］。盡管干旱脅迫對供試品種葉片和根系C、N含量沒有顯著影響，但干旱脅迫顯著增加了WL363HQ和巨能7紫花苜蓿根系的δ13C。這可能是因為干旱脅迫降低了紫花苜蓿的氣孔導(dǎo)度，限制了CO2向羧化位點的供應(yīng)［31］，降低了C同位素的分餾，增加了光合同化產(chǎn)物中的13C的比例，且這部分增加的光合產(chǎn)物通過木質(zhì)部轉(zhuǎn)運到了根系［32］。干旱脅迫降低了土壤N的有效性，紫花苜蓿更加依賴生物固氮獲取N［33］，這是干旱脅迫下兩個供試品種根系δ15N均降低的重要原因之一。此外，本研究中WL 363HQ葉片和根系的δ15N均顯著高于巨能7，說明WL 363HQ紫花苜蓿的N代謝活性較高，即使在干旱脅迫下也能維持較高N代謝及N轉(zhuǎn)運的效率［34］，這也是WL 363HQ在干旱脅迫下生物量較高的另外一個重要原因。然而植物的δ15N受到土壤硝化、植物吸收特性（如時間和吸收類型）和微生物侵染率等的影響［34］，有關(guān)紫花苜蓿不同組織δ15N響應(yīng)水分脅迫的深層次的原因還需深入研究。根系C/N的變化是植物適應(yīng)環(huán)境的重要信號調(diào)節(jié)機制［35］，反映了植物C、N營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及轉(zhuǎn)運策略［36］。值得注意的是，本研究中干旱脅迫僅增加了巨能7紫花苜蓿的C/N，這說明紫花苜蓿生物量的分配模式、營養(yǎng)物質(zhì)的濃度與其根系C/N計量關(guān)系存在一定的聯(lián)系，植物采用適應(yīng)性策略，調(diào)整器官C/N，優(yōu)化了生理防御與生長發(fā)育之間的協(xié)同關(guān)系［37］。本研究中干旱脅迫下供試品種C、N代謝參數(shù)并沒有在葉片和根系水平上表現(xiàn)出較為明顯的品種特異性規(guī)律，深層次的機制還有待進一步探討。

4 結(jié)論

干旱脅迫下紫花苜蓿WL 363HQ和巨能7的株高和根冠比都具有品種特異性的規(guī)律；干旱脅迫下供試品種的葉片和根系MDA和脯氨酸的含量及抗氧化酶的活性在器官水平也具有品種特異性規(guī)律。干旱脅迫增加了WL 363HQ和巨能7根系的δ13C，提高了巨能7葉片和根系的C/N，但是C、N代謝參數(shù)并沒有在葉片和根系水平上表現(xiàn)出較為一致的品種特異性規(guī)律。在對照和干旱脅迫下，WL 363HQ相比巨能7具有相對較高的生物量，其葉片和根系也具有相對較強的滲透調(diào)節(jié)和抗氧化協(xié)同能力及相對較高的N代謝活性（δ15N）。