王軍松，李 佳，劉桂奇

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 骨科，北京 100853

隨著年齡增長(zhǎng)，人體內(nèi)各器官功能逐漸退化，骨量也逐漸減少，最終引起骨質(zhì)疏松。目前骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)已成為危害老年人健康的常見(jiàn)疾病，有流行病學(xué)研究調(diào)查顯示，2006年我國(guó)有將近7 000萬(wàn)人患有OPF，年齡大多在50歲以上[1]。OPF患者成骨能力差，骨折愈合難以達(dá)到理想狀態(tài)，部分患者甚至因骨折愈合延遲而死亡，所以尋找能有效改善骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨愈合的藥物十分必要[2-3]。骨碎補(bǔ)作為傳統(tǒng)中藥，是蕨類(lèi)植物槲蕨的干燥根莖，有補(bǔ)腎強(qiáng)固、消風(fēng)祛斑的功效[4]。骨碎補(bǔ)總黃酮(total flavonoids of rhizome drynariae，TFRD)是骨碎補(bǔ)的主要活性成分，近年來(lái)許多研究表明TFRD可有效提高骨質(zhì)疏松癥患者骨密度，促進(jìn)OPF患者骨愈合，但其作用的具體分子機(jī)制尚不完全明確[5-6]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化為成骨細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用[7]。本研究對(duì)BMSCs細(xì)胞進(jìn)行TFRD干預(yù)，并觀察TFRD對(duì)BMSCs細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步探討TFRD促進(jìn)OPF患者骨愈合的作用機(jī)制。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠10只，均為6月齡，平均體質(zhì)量(92.14±8.53) g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2主要儀器與試劑 倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(上海力康發(fā)展有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀(ABI公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSVERSE公司，美國(guó))，微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)，凝膠成像儀(Bio-Rad公司，美國(guó))。強(qiáng)骨膠囊 (北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：20030007，規(guī)格：0.25 g；其有效成分為骨碎補(bǔ)總黃酮)，胎牛血清(Hy-Clone公司)，LDMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，Trizol試劑(天根生化有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，β-catenin、RunX2、PPARG一抗以及GAPDH一抗(優(yōu)寧維生物科技有限公司)，二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)。

3BMSCs的培養(yǎng)和鑒定 10只SD大鼠處死后，將兩側(cè)股骨取出，采用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，調(diào)整骨髓腔沖洗液細(xì)胞密度至2×107/mL，然后接種于培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基，后每2 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合80%～90%時(shí)，采用胰酶消化傳代，并繼續(xù)培養(yǎng)。采用細(xì)胞流式法對(duì)第三代(P3)細(xì)胞表面抗原(CD29、CD44和CD45)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

4實(shí)驗(yàn)分組 在含青鏈霉素、10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基中加入不同濃度的TFRD藥物，根據(jù)TFRD濃度的不同分為低濃度組(TFRD 0.1mg/L)、中濃度組(TFRD1.0mg/L)、高濃度組(TFRD 10.0mg/L)。

5CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 調(diào)整BMSCs細(xì)胞密度至1×104/孔，接種于已加入上述3個(gè)濃度的TFRD培養(yǎng)基和不含TFRD培養(yǎng)基的96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d后取出96孔板，每孔加入CCK8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)下各孔吸光度值。

6成骨分化鑒定 將P3代BMSCs細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104/孔后，接種于6孔板，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，每3 d換液1次，持續(xù)培養(yǎng)21 d后取出6孔板，經(jīng)95%乙醇固定后采用0.2%茜素紅染色。在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察礦化結(jié)節(jié)情況并計(jì)數(shù)，以平均數(shù)形式表示。

7mRNA檢測(cè) P3代BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)至21 d后，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)熒光PCR將獲取到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算各組2-ΔΔCT值，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件：95℃5min，56℃30s，72℃40s，76℃ 2 s，共42個(gè)循環(huán)。各檢測(cè)基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列Tab. 1 Primer sequence of each gene

8Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 提取BMSCs總蛋白后，采用BCA法進(jìn)行Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白定量。制作SDS-PAGE凝膠，每孔加入BMSCs總蛋白樣品30μL進(jìn)行電泳，電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，在常溫下封閉2 h，加入一抗，低溫孵育過(guò)夜，膜洗凈后，加入二抗常溫孵育1 h，膜洗凈后在暗室滴加顯影液顯影并拍照，采用Quantityone軟件分析條帶灰度。

9數(shù)據(jù)分析 將數(shù)據(jù)錄入Excel，應(yīng)用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示。依時(shí)間變化計(jì)量資料比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩精細(xì)比較行LSD-t檢驗(yàn)，時(shí)間兩兩精細(xì)比較行差值t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1BMSCs形態(tài)觀察及鑒定 BMSCs接種培養(yǎng)24 h后貼壁生長(zhǎng)，數(shù)量少，呈短紡錘狀。3 d后，細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，呈多角形或梭形。7 d后，細(xì)胞開(kāi)始相互融合。10d后，80%～90%細(xì)胞呈融合狀態(tài)。傳代接種12 h內(nèi)細(xì)胞貼壁，呈紡錘形，5 d后密度達(dá)到80%以上(圖1A)。P3代BMSCs細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD29、CD44和CD45陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為78.56%、85.48%和1.29%(圖1B)。

圖1 大鼠BMSCs細(xì)胞形態(tài)和表面抗原鑒定A：5 d后P1細(xì)胞形態(tài)圖(100×)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3細(xì)胞表面抗原Fig.1 Cell morphology and surface antigen identification of BMSCs in ratsA: Cell morphological image after 5 days of P1 (100×); B: Cell surface antigen of P3 by flow cytometry

2不同濃度TFRD對(duì)BMSCs增殖的影響 通過(guò)雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，培養(yǎng)時(shí)間(P＜0.01)和TFRD濃度(P＜0.01)對(duì)BMSCs增殖均有顯著影響，而二者之間無(wú)交互作用(P=0.27)。不同濃度的TFRD分組之間兩兩比較顯示，中濃度組與高濃度組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.31)，其他各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度TFRD對(duì)BMSCs增殖的影響(aP＜0.01, vs對(duì)照組；bP＜0.01, vs低濃度組)Fig.2 Effects of different concentrations of TFRD on proliferation of BMSCs (aP＜0.01, vs control group; bP＜0.01, vs low concentration group)

3不同濃度TFRD對(duì)BMSCs成骨分化的影響各組P3代細(xì)胞培養(yǎng)21 d后進(jìn)行茜素紅染色，低濃度組、中濃度組、高濃度組均可見(jiàn)邊界清晰的橘紅色礦化結(jié)節(jié)，對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)則較少(圖3)。統(tǒng)計(jì)各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)，結(jié)果顯示對(duì)照組(6.48±1.13)個(gè)、低濃度組(12.25±1.18)個(gè)、中濃度組(15.94±2.26)個(gè)、高濃度組(13.44±1.51)個(gè)，中濃度組礦化結(jié)節(jié)數(shù)高于其他三組(P＜0.05)。

圖3 BMSCs細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化后茜素紅染色結(jié)果Fig.3 Induction of alizarin red staining after osteogenic differentiation of BMSCs cells

4TFRD對(duì)BMSCs中β-catenin、RunX2、PPARG表達(dá)的影響 中濃度組與對(duì)照組比較，β-catenin和RunX2表達(dá)明顯升高，PPARG表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。見(jiàn)表2，圖4。

表2 TFRD對(duì)BMSCs中β-catenin、RunX2、PPARG表達(dá)的影響Tab. 2 Effect of TFRD on expression of β-catenin, RunX2 and PPARG in BMSCs

圖4 兩組BMSCs中各蛋白Western blot檢測(cè)Fig.4 Western blot results of each protein in BMSCs of the control group and the medium concentration group

討 論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎精的盛衰是決定骨生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵，腎精不足，則不能榮髓，髓不榮則不能生骨，故骨質(zhì)疏松應(yīng)以補(bǔ)腎壯骨為治療原則[8]。骨碎補(bǔ)屬于補(bǔ)腎壯骨類(lèi)中藥，其主要有效成分為T(mén)FRD，TFRD是一類(lèi)二氫黃酮類(lèi)化合物?，F(xiàn)代藥理研究顯示，骨碎補(bǔ)能夠有效促進(jìn)骨的形成，在防治骨質(zhì)疏松方面效果明顯，特別是其有效活性成分總黃酮已成為研究熱點(diǎn)[9]。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TFRD可提高老年骨質(zhì)疏松患者血清骨鈣素水平以及骨密度[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TFRD可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖，并影響成骨分化[11]。BMSCs是具有自我復(fù)制、多向分化能力的干細(xì)胞，在體外特定條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞系定向分化。BMSCs成骨細(xì)胞分化能力降低、成脂分化能力增強(qiáng)與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生有關(guān)，而多種信號(hào)通路參與了BMSCs成骨細(xì)胞或成脂分化過(guò)程[12-14]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是BMSCs成骨細(xì)胞分化調(diào)控的經(jīng)典路徑，該通路調(diào)控機(jī)制如下：Wnt蛋白與LRP5/6和Frizzled受體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)散落蛋白，進(jìn)而激活GSK-3β結(jié)合蛋白，而后者通過(guò)影響β-catenin的磷酸化以阻止其降解，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不斷增多，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[15-16]。由此可見(jiàn)，β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的樞紐蛋白，在細(xì)胞增殖分化中扮演重要角色，其表達(dá)上調(diào)使BMSCs成骨細(xì)胞分化能力增強(qiáng)。RUNX2是成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)增強(qiáng)Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白等基因轉(zhuǎn)錄，達(dá)到促進(jìn)成骨分化的目的[17]。PPARG是BMSCs成脂分化過(guò)程的關(guān)鍵因子，其通過(guò)促進(jìn)骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，使骨髓脂肪增多，骨形成減少[18]。

本研究采用CCK8法檢測(cè)TFRD對(duì)SD大鼠BMSCs細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示低濃度組、中濃度組、高濃度組在不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值均明顯高于對(duì)照組，提示TFRD可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖。而中、高濃度組與低濃度組之間吸光度值也存在明顯差異，而中、高濃度之間差異不明顯，說(shuō)明TFRD對(duì)BMSCs增殖作用存在一定的對(duì)數(shù)關(guān)系，在濃度較低時(shí)，隨著TFRD濃度升高，對(duì)大鼠BMSCs增殖的促進(jìn)作用會(huì)更強(qiáng)，當(dāng)TFRD濃度達(dá)到一定濃度后，這種促增殖作用不會(huì)隨濃度增加而增加。TFRD的這種作用在3 d和5 d時(shí)增殖最快，在7 d和9 d時(shí)增殖速度減慢。原因可能是細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度后，生長(zhǎng)空間受限，影響了其增殖。P3代細(xì)胞培養(yǎng)21 d后經(jīng)茜素紅染色，結(jié)果顯示低濃度組、中濃度組、高濃度組礦化結(jié)節(jié)數(shù)明顯多于對(duì)照組，且中濃度組礦化結(jié)節(jié)數(shù)最多。提示TFRD可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞成骨分化，且當(dāng)TFRD濃度為1.0mg/L時(shí)，BMSCs細(xì)胞成骨分化能力最強(qiáng)，所以選擇中濃度組進(jìn)行后續(xù)研究。收集培養(yǎng)了21 d的P3代BMSCs細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-catenin、RunX2、PPARG mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示中濃度組β-catenin、RunX2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，PPARG mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組，蛋白表達(dá)情況與mRNA表達(dá)情況一致。以上說(shuō)明TFRD可激活Wnt/β-catenin通路，通過(guò)上調(diào)βcatenin、RunX2表達(dá)，抑制PPARG表達(dá)，減少成脂分化，促進(jìn)成骨分化。

綜上所述，TFRD促進(jìn)OPF患者骨愈合的機(jī)制可能與上調(diào)β-catenin、RunX2表達(dá)，抑制PPARG表達(dá)有關(guān)。當(dāng)然除了Wnt/β-catenin通路外，還有許多信號(hào)通路參與了BMSCs的成骨分化，TFRD是否可調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，還需進(jìn)一步探索。