王 洋，王良宸，萬(wàn)麗娟，張宇軒，廖思達(dá)，孟昊業(yè)，李春霖，龔燕平

1 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院 骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100853

骨折是骨科臨床最常見(jiàn)問(wèn)題之一，其中四肢骨折最為常見(jiàn)。長(zhǎng)骨骨折通常是由于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、高空墜落和交通事故等劇烈撞擊導(dǎo)致，其中股骨干骨折、肱骨骨折和脛骨骨折分別占成人骨折的3%、14%和24%[1]。汶川地震德陽(yáng)醫(yī)院共收治地震致骨折患者596例，其中上肢骨折132例(22.1%)，下肢骨折496例(83.2%)。部分骨折患者出現(xiàn)的骨不連和骨折愈合延遲仍是當(dāng)今臨床上的巨大挑戰(zhàn)[2]。目前常用的治療方法有自體骨移植物治療和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)治療，BMP存在來(lái)源難尋、成本高和不良反應(yīng)重等相關(guān)問(wèn)題，導(dǎo)致了治療效果有限。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)最初被認(rèn)為是一種脂肪源性激素[3]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)骨骼肌、骨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也能產(chǎn)生脂聯(lián)素。但脂肪組織仍然是血清脂聯(lián)素的主要產(chǎn)生者，脂聯(lián)素在血清中約占血清蛋白質(zhì)的0.01%(5～10mg/L)[4]；其具有多種生物學(xué)功能，如提高胰島素敏感度，降低高血壓風(fēng)險(xiǎn)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化、肝纖維化和腫瘤生長(zhǎng)等[5]。近年來(lái)有研究表明骨骼與脂肪有著密切聯(lián)系[6-7]，脂聯(lián)素作為脂肪因子，具有加速成骨、抑制破骨的作用[8]。因此，我們用局部注射重組脂聯(lián)素的方法治療SD大鼠脛骨閉合性骨折，觀察脂聯(lián)素對(duì)大鼠骨折愈合過(guò)程中骨痂形成、成骨因子表達(dá)和骨微結(jié)構(gòu)重建的影響。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague Dawley(SD)雄性大鼠18只，體質(zhì)量約200 g，二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由斯貝福(北京)生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK (京)2016-0002。飼養(yǎng)于光照充足，通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫20℃～25℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

2脂聯(lián)素合成 在NCBI搜索人脂聯(lián)素蛋白的氨基酸序列，在C端融合IgG-Fc片段，經(jīng)密碼子優(yōu)化后得到cDNA序列。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR) 擴(kuò)增cDNA序列，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，割膠回收。ADPN片段與經(jīng)Bglll和BamHl(蘇州思坦維公司1021A，1010S)消化后的Fc-GS質(zhì)粒融合，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌培養(yǎng)過(guò)夜。離心柱式提取試劑盒提取擴(kuò)增質(zhì)粒。質(zhì)粒用HindⅢ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(A001303，B600236，上海)消化，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序。電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞(Invitrogen公司)。蛋氨酸亞氨基代砜 (Methionine sulfoximine,MSX，SIGMA，M5379) 篩選和Protein A層析柱純化。

3動(dòng)物脛骨閉合性骨折模型制作 大鼠禁食12 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，皮膚消毒，將右后肢固定于骨折造模器鐵砧上，暴力撞擊脛骨中下1/3處的前方造成閉合性骨折。從脛骨粗隆下0.5cm處穿入7號(hào)針頭進(jìn)行髓內(nèi)固定，穿入深度到底后剪除針頭外露部分。術(shù)后腹腔注射100000U青霉素預(yù)防感染。

4分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)，脂聯(lián)素治療1組 (APN劑量1mg/kg)，脂聯(lián)素治療 2 組(APN劑量2mg/kg)，正常對(duì)照為對(duì)側(cè)脛骨，每組6只。各組均在造模后立即骨折處局部注射0.5mL藥物1次。

5標(biāo)本采集 大鼠骨折造模6周后，處死大鼠取出雙側(cè)脛骨，用4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA脫鈣4周，隔日換液。將部分標(biāo)本經(jīng)自動(dòng)脫水機(jī)脫水(Leica，ASP200S)，石蠟包埋機(jī)包埋(Histecore，Areadia H)。

6HE染色和Masson染色 石蠟切片，厚度為5μm，進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察骨折部位骨小梁、板層骨重建等情況。組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色10min，分化液分化30 s，自來(lái)水浸泡15min，伊紅染色液1min，自來(lái)水沖洗、浸泡5min，常規(guī)脫水透明封片，觀察骨折處骨小梁、板層骨情況。Masson染色按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(索萊寶，G1340)，觀察骨折處膠原蛋白表達(dá)情況。

7免疫熒光染色 部分標(biāo)本經(jīng)30%蔗糖脫水后，冷凍切片，厚度7μm，進(jìn)行免疫熒光染色，觀察骨鈣素骨鈣素(osteocalcin，OCN)(Abclonal，A6205)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(Abcam，ab95462)表達(dá)情況。標(biāo)本經(jīng)PBS洗3次后用3%過(guò)氧化氫進(jìn)行過(guò)氧化物酶滅活，羊血清封閉后，加一抗4℃冰箱過(guò)夜，加熒光二抗，室溫孵育1 h后加DABI，水性封片后在熒光顯微鏡(Olympus，BX51TR)下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察拍照，并用ImageJ 1.51分析圖像的熒光表達(dá)強(qiáng)度及面積。

8micro-CT分析 micro-CT(P2000RS，GE healthcare，USA；System：RS-9)參數(shù)設(shè)置為45 μm-ss，80 kV，450 μA，Air 0.25，Water 13.84，Bone：3421。興趣區(qū)(ROI)設(shè)定為骨折線上下各0.5mm。通過(guò)機(jī)器配套軟件microView 2.1計(jì)算分析得到骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁空間(Tb.Sp)。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料均為計(jì)量數(shù)據(jù)，以表示，采用單因素方差分析+兩兩比較LSD檢驗(yàn)分析各組差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1骨折6周后各組愈合情況大體觀 骨折造模后6周時(shí)處死大鼠取出雙側(cè)脛骨，脂聯(lián)素治療組骨折線幾乎消失，骨折基本愈合完畢，空白組還留有較明顯的骨折線。見(jiàn)圖1。

圖1 造模6周后各組大鼠脛骨愈合情況大體觀(右側(cè)標(biāo)本為正常對(duì)照，左側(cè)為骨折模型組，黃色圓圈部分是骨折斷端)Fig.1 general view of tibial healing after 6 weeks of fracture (In each figure, the right tibia is the normal control, the left is the fractured tibia. The yellow circle indicates the broken end of the fracture)

2骨折處骨痂HE染色結(jié)果 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素治療組內(nèi)骨痂、外骨痂厚度高于對(duì)照組，骨小梁增多明顯，板層骨厚度形成明顯優(yōu)于對(duì)照組，骨痂改建好。見(jiàn)圖2。

圖2 骨折處骨痂HE染色圖 （紅染部分為骨質(zhì)，骨小梁穿插其間)Fig.2 Results of HE staining of bone callus (The red stained part is bone, with trabeculae interspersed)

3骨折處骨痂Masson三色染色結(jié)果 成熟骨組織中膠原著紅色，骨痂愈合過(guò)程中隨著骨成熟度升高，紅染越來(lái)越多，與對(duì)照組相比，治療組紅染更多，提示膠原合成更多，骨骼成熟度更高。見(jiàn)圖3。

圖3 骨折處骨痂Masson染色圖(紅染部分為膠原染色，藍(lán)染部分為礦化骨)Fig.3 Results of Masson staining of bone callus (The red stained part is collagen, and the blue stained part is mineralized bone)

4骨折處骨痂免疫熒光觀測(cè)結(jié)果 成骨細(xì)胞聚集的骨膜和骨陷窩處，高倍鏡視野下1mg/kg治療組促成骨相關(guān)因子OCN、ALP表達(dá)量分別為0.61%±0.21%、0.86%±0.63%，2mg/kg治療組為0.44%±0.17%、0.70%±0.34%，均優(yōu)于對(duì)照組的0.27%±0.17%、0.35%±0.15%(P< 0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 骨折處骨痂免疫熒光染色圖(白色箭頭所指為骨膜，黃色箭頭所指為骨陷窩)Fig.4 Results of immunofluorescence staining of callus (The white arrow indicates periosteum and the yellow arrow indicates lacunae)

5骨痂處骨微結(jié)構(gòu) micro-CT分析顯示，對(duì)照組、1mg/kg治療組和2mg/kg組，BV/TV分別為26.37%±4.32%、53.76%±7.89%和45.10%±5.45%，Tb.Th分別為(269.6±36.80) μm、(363.9±51.45) μm、(296.5±24.33) μm，Tb.N分別為(10.51±1.49)/cm、(15.68±2.11)/cm、(14.4±1.83)/cm，Tb.Sp分別為(604.3±78.27) μm、(344.6±98.79) μm、(436.1±63.75) μm。脂聯(lián)素1mg/kg治療組骨痂處BV/TV和Tb.Sp均優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，脂聯(lián)素 2mg/kg治療組BV/TV、Tb.N和Tb.Sp優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，但Tb.Th與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

圖5 micro-CT檢測(cè)骨折處骨痂微結(jié)構(gòu)(aP < 0.05，bP < 0.01)Fig.5 micro-CT results of bone callus (aP < 0.05, bP < 0.01)

討 論

既往有研究表明，脂聯(lián)素可以逆轉(zhuǎn)OVX誘導(dǎo)的肌萎縮、身體成分和能量代謝的變化，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)骨骼穩(wěn)態(tài)的重要因素[9-12]。Kajimura等[13]發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素根據(jù)動(dòng)物年齡的大小具有不同的骨骼效應(yīng)，其會(huì)抑制幼鼠的骨量增加，但可以促進(jìn)成熟小鼠的骨量增加。因此脂聯(lián)素對(duì)于骨骼的作用尚未明確，是否能促進(jìn)大鼠閉合型骨折愈合未有研究。我們的研究證實(shí)脂聯(lián)素可以促進(jìn)大鼠的骨折愈合。

骨折時(shí)，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的協(xié)調(diào)作用，使骨折處的骨痂經(jīng)骨吸收、骨重塑等過(guò)程逐漸變?yōu)檎９趋?。骨折愈合在時(shí)間上可分為炎癥期、軟骨痂期、硬骨痂期和骨重塑期，這些階段有一些重疊[14-15]。既往有研究表明脂聯(lián)素可以保護(hù)軟骨細(xì)胞[16]，并可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化[17]。骨折愈合程序可以由損傷觸發(fā)，局部組織出現(xiàn)血腫和炎癥，加速骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在骨損傷處的募集，細(xì)胞的趨化作用和募集有利于血腫炎癥期后的成軟骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞分化。脂聯(lián)素可以使骨髓腔中的CXCL12表達(dá)降低，但其在外周血中水平上會(huì)升高，這會(huì)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞從骨髓遷移到外周循環(huán)，并重新募集到骨折部位，為骨折部位的骨小梁生成和骨骼重塑提供細(xì)胞基礎(chǔ)[18-19]。本研究通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，治療組骨痂重建更好，骨痂更厚。Masson染色結(jié)果顯示，應(yīng)用脂聯(lián)素后，骨痂成熟度更高。micro-CT結(jié)果也提示治療組骨痂的微結(jié)構(gòu)Tb.Th、Tb.N及Tb.Sp均優(yōu)于對(duì)照組。

BMP信號(hào)通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)骨和軟骨發(fā)育、再生的重要途徑，在骨細(xì)胞分化和成熟過(guò)程中起重要作用[20]。其與有絲氨酸蘇氨酸激酶活性的特定細(xì)胞表面受體結(jié)合特異性地轉(zhuǎn)導(dǎo)BMP信號(hào)，誘導(dǎo)受體調(diào)節(jié)的Smads(Smad1、5、8)磷酸化以激發(fā)其功能，并在骨細(xì)胞中大量表達(dá)OCN、ALP以促進(jìn)成骨[21]。在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，BMP-2的mRNA水平在骨折后24 h內(nèi)即可達(dá)到高峰，并且BMP-2可以調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中其他幾種類型蛋白的表達(dá)，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否成功分化為成骨細(xì)胞的關(guān)鍵[22]。Kloen首次報(bào)道接受外科手術(shù)骨折患者骨痂中BMP的表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果顯示，在軟骨內(nèi)骨化區(qū)的BMP-2和BMP-4表達(dá)增加，而且在新形成的類骨質(zhì)中表達(dá)更高。BMP-3和BMP-7只在類骨質(zhì)中大量表達(dá)。OCN可以由脂肪、肌肉、睪丸等多器官分泌，是骨形成的決定因素[23]。OCN作為一種最豐富的成骨細(xì)胞特異性非膠原蛋白，最初是一種前體激素Pro-OCN，分泌前會(huì)在維生素K的輔助下，在成骨細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中羧基化，增強(qiáng)其對(duì)Ca2+和羥基磷灰石的親和力，轉(zhuǎn)變?yōu)橛泄δ艿募?xì)胞因子。OCN與骨發(fā)育、骨代謝關(guān)系密切，可以促進(jìn)新骨形成和骨損傷的修復(fù)[24-25]。ALP在骨骼成熟及骨骼礦化的過(guò)程中有著重要的作用。在體內(nèi)ALP可以促進(jìn)羥基磷灰石在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)還能有效促進(jìn)骨細(xì)胞中鈣的沉積，從而加強(qiáng)成骨和骨骼重塑的作用。我們通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)治療組的骨痂OCN、ALP表達(dá)升高。因此我們推測(cè)在大鼠骨折愈合過(guò)程中脂聯(lián)素可能是通過(guò)BMP/Runx2信號(hào)通路發(fā)揮作用，促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中成骨因子表達(dá)以加速愈合。

綜上所述，脂聯(lián)素在促進(jìn)SD大鼠骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮了積極作用，其可能通過(guò)促進(jìn)成骨因子表達(dá)促進(jìn)骨折愈合。