孫夢娜，葉輝宇，李強明，張玉英，楊思林，魏春廳，羅建平

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601）

（2.安徽省華信生物藥業(yè)股份有限公司，安徽界首 236500）

失眠癥是最常見的心理疾病之一，其特征是難以啟動或維持睡眠，并伴有諸如清醒時的煩躁或疲勞等癥狀[1]。與其他疾病相比，失眠綜合癥非常普遍。據(jù)報道，一般人群中有6%至50%的人有失眠癥狀，10%至15%的人曾忍受過失眠癥引起的疼痛。在中國，失眠的總患病率為15%，約20.7億人存在睡眠問題[2,3]。然而，常見的催眠藥雖然有較好的治療失眠癥的作用，但是會出現(xiàn)很多明顯的副作用，尤其是苯二氮卓類藥物，使用它們會引起運動和認知障礙等副作用[4,5]。面對這些局限，人們傾向于尋求天然藥物來治療或緩解失眠癥狀，中藥是一種天然藥物，并且歷代醫(yī)書記載了大量具有改善睡眠功效的中藥單味方藥，為治療失眠提供了可借鑒的經(jīng)驗[6]。

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf的干燥菌核[7]，多寄生于松科植物赤松或馬尾松等樹根上，是藥食兩用、臨床運用最多的大宗和傳統(tǒng)中藥材，有“十方九苓”之說[8]，具有利水滲濕、健脾寧心等功效[9]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將茯苓列為上品藥材，認為它“久服安魂養(yǎng)神，不饑延年”[10]；《本草備要》指出茯苓可以“寧心益氣，調(diào)營理衛(wèi)，定魄安魂”[11]。民間常用茯苓調(diào)理睡眠[12]，傳統(tǒng)助眠中藥復(fù)方，如歸脾湯[13]、天王補心丸[14]、安神利眠湯[15]、疏肝健脾安神湯[16]等都含有茯苓。

現(xiàn)代研究表明，茯苓具有免疫調(diào)節(jié)[17]、抗炎、抗氧化[18]、鎮(zhèn)靜與催眠[19]等生物活性，其主要活性成分為三萜類和多糖類化合物[6]。藥理學(xué)實驗證明了茯苓不同提取成分都具有鎮(zhèn)靜、催眠作用[20,21]，但是研究報道的動物模型、提取方法、給藥劑量和生藥來源各不相同，因此無法對茯苓不同成分在改善睡眠作用的強弱方面進行直接比較，進而制約了茯苓中有助于改善睡眠的功能因子的開發(fā)與利用。本研究以同一來源的茯苓為原料，基于相同生藥劑量，分別提取茯苓水提物、醇提物和多糖，運用相同動物模型對三種提取物的改善睡眠作用進行比較，以期為合理開發(fā)和有效利用茯苓中改善睡眠的功能因子提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

茯苓粉末（過100目篩）購于江蘇濱海宏本堂商貿(mào)有限公司；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉（≥99%）均購于北京華業(yè)寰宇化工有限公司；羅通定片購于四川迪菲特藥業(yè)有限公司；五羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）和多巴胺（DA）酶聯(lián)免疫吸附（ELSIA）試劑盒均購于上海澤宇生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（純度為98%）、乙醇（純度為95%）購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

W-205數(shù)控恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術(shù)有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博康實驗儀器有限公司；CT15RT高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；XT5118-OV140恒溫干燥箱，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

1.3 實驗動物

ICR健康雄性小鼠320只，2~3月齡，體質(zhì)量18~22 g，飼養(yǎng)于SPF級動物房（溫度24±2 ℃，相對濕度50%~60%，明暗交替12 h），由山東濟南朋越繁育有限公司提供，動物許可證號為SCXK（魯）2014-0007。

1.4 實驗方法

1.4.1 茯苓不同溶劑提取物的制備

水提物的制備[22]：稱取適量茯苓粉末，按照1:30的料液比加入雙蒸水，90 ℃水浴浸提2 h，共2次，將所得浸提液抽濾，合并濾液，65 ℃減壓濃縮，冷凍干燥得到茯苓水提物（提取率為2.82%±0.25%）。

醇提物的制備[23]：稱取適量茯苓粉末，按照1:30的料液比加入95%乙醇，60 ℃水浴浸提2 h，共2次，藥渣60 ℃干燥備用，將所得醇提液抽濾，合并濾液，65 ℃減壓濃縮，60 ℃干燥至無醇味，得到茯苓醇提物（得率為2.52%±0.17%）。

多糖的制備[24]：稱取適量制備醇提物的干藥渣，按照1:30的料液比加入雙蒸水，90 ℃浸提2 h，共2次，將所得浸提液抽濾，合并濾液，65 ℃減壓濃縮，在4 ℃下用終濃度為80%的乙醇醇沉2次每次24 h，冷凍干燥得到茯苓多糖（得率為0.39%±0.09%）。

1.4.2 實驗分組、給藥方法和劑量設(shè)置

參照文獻[25,26]，本實驗包括直接睡眠實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗4部分，其中直接睡眠實驗和小鼠腦組織中5-HT、GABA、DA含量測定實驗使用同一批動物。每個實驗各80只小鼠，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為8組（n=10），分別為空白對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉）、陽性組（羅通定片，15 mg/kg）、水提物高劑量和低劑量組、醇提物高劑量和低劑量組以及多糖高劑量和低劑量組。以《中華人民共和國藥典（2020版）一部》中茯苓的人體（60 kg）推薦攝入量（9~15 g/d）中值（12 g/d）的10倍、20倍為依據(jù)[1]，結(jié)合茯苓不同溶劑提取物的提取率，確定水提物低劑量和高劑量組給藥濃度為56.4 mg/kg和112.7 mg/kg，醇提物低劑量和高劑量組給藥濃度為50.4 mg/kg和100.8 mg/kg，多糖低劑量和高劑量組給藥濃度為7.8 mg/kg和15.6 mg/kg。茯苓不同溶劑提取物和陽性組藥物的溶劑均為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每組小鼠按照10 mL/kg劑量灌胃，連續(xù)灌胃30 d，觀察各組小鼠體重變化及睡眠情況。

1.4.3 小鼠體重及臟器指數(shù)測定

實驗前后，稱取小鼠體重，觀察各組小鼠實驗前后體重變化。實驗結(jié)束后，用二氧化碳處死小鼠，解剖臟器，計算小鼠臟器指數(shù)。小鼠臟器指數(shù)計算公式：臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.4.4 直接睡眠實驗

小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次給藥15 min后觀察各組小鼠在60 min內(nèi)入睡只數(shù)。睡眠以翻正反射消失為指標，即當小鼠置于背臥式時，超過1 min不能翻正者即認為進入睡眠。

1.4.5 延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間實驗

小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次給藥15 min后，各組小鼠腹腔注射經(jīng)預(yù)實驗確定劑量為38 mg/kg的戊巴比妥鈉溶液，注射量為0.2 mL/20 g，以翻正反射消失1 min以上為入睡判斷標準，記錄各組小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時間。

1.4.6 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次給藥15 min后，各組小鼠腹腔注射經(jīng)預(yù)實驗確定劑量為24 mg/kg的戊巴比妥鈉溶液，注射量為0.2 mL/20 g，以翻正反射消失1 min以上作為入睡指標，記錄各組小鼠入睡只數(shù)及入睡時間。

1.4.7 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次給藥15 min后，各組小鼠腹腔注射經(jīng)預(yù)實驗確定劑量為230 mg/kg的巴比妥鈉，注射量為0.2 mL/20 g。以翻正反射消失1 min以上作為入睡指標，記錄各組小鼠的睡眠潛伏期。

1.4.8 小鼠腦組織中5-HT、GABA、DA含量的測定

灌胃30 d后，小鼠禁食一天，用二氧化碳處死小鼠，迅速取出腦組織，冰浴勻漿，4 ℃、8000 r/min離心，取上清，采用ELISA試劑盒法測定5-HT、GABA、DA含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，x±SD表示數(shù)據(jù)，以單因素方差分析（ANOVA）進行差異顯著性檢驗，p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑提取物對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

動物體重和臟器指數(shù)分析顯示，與空白對照組相比，茯苓水提物、醇提物、多糖等三種提取物不同劑量對小鼠體重?zé)o明顯影響（表1），各組小鼠體重增長趨勢一致，皮毛有光澤，飲食、活動正常，且肺、肝、脾、腎和胸腺的臟器指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異（表2），表明茯苓不同溶劑提取物在本試驗設(shè)計劑量下對小鼠正常生長無影響（p>0.05）。

表1 不同溶劑提取物對小鼠體重的影響Table 1 Effects of different extracts on body weight in mice (±sd, n=10)

表1 不同溶劑提取物對小鼠體重的影響Table 1 Effects of different extracts on body weight in mice (±sd, n=10)

注：不同字母標注表示在p<0.05水平差異上顯著。下表同。

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表2 不同溶劑提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of different extracts on viscera index of mice (±sd, n=10)

表2 不同溶劑提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of different extracts on viscera index of mice (±sd, n=10)

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2.2 直接睡眠實驗

小鼠連續(xù)灌胃不同溶劑提取物30 d，在末次給藥60 min內(nèi)觀察小鼠睡眠情況，各組小鼠均未出現(xiàn)翻正反射消失，說明茯苓不同溶劑提取物對小鼠無直接睡眠作用。

2.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

小鼠連續(xù)灌胃不同溶劑提取物30 d，在末次給藥15 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為38 mg/kg，注射量為0.2 mL/20 g），記錄各組小鼠睡眠時間。如表3所示，陽性組小鼠睡眠時間最長，其后依次為水提物高劑量組、醇提物高劑量組、多糖高劑量組、水提物低劑量組、醇提物低劑量組和多糖低劑量組。與空白對照組相比，水提物高劑量組、醇提物高劑量組、多糖高劑量組、水提物低劑量組和醇提物低劑量組均能顯著延長小鼠睡眠時間（p<0.05），小鼠睡眠時間與空白對照組相比分別延長了44.02%、26.83%、23.71%、21.58%和15.91%，以水提物高劑量組效果最佳（p<0.01），而多糖低劑量組對延長小鼠睡眠時間的影響不顯著（p>0.05）。徐煜彬等的研究也表明了生藥42.8 g/kg茯苓水煎液可顯著延長閾上劑量戊巴比妥鈉引起小鼠睡眠時間[19]。Shah等報道茯苓酸在劑量分別為3 mg/kg、5 mg/kg時可以延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時間[27]。趙天國采用協(xié)同戊巴比妥實驗研究茯苓多糖對小鼠睡眠的改善作用，結(jié)果顯示茯苓多糖低[1.9 g/（kg?BW?d）]、中[3.61 g/（kg?BW?d）]、高[5.80 g/（kg?BW?d）]劑量均具有顯著延長睡眠時間的作用，睡眠時間分別延長了55.7 min、63.2 min、73.2 min，其作用效果呈劑量依賴性[28]。

表3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗Table 3 Prolong the sleep time of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

表3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗Table 3 Prolong the sleep time of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

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2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

小鼠連續(xù)灌胃不同溶劑提取物30 d，在末次給藥15 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為24 mg/kg，注射量為0.2 mL/20 g），記錄各組小鼠睡眠發(fā)生率。如表4所示，陽性組睡眠發(fā)生率最高，其后依次為水提物高劑量組、醇提物高劑量組、多糖高劑量組、水提物低劑量組、醇提物低劑量組和多糖低劑量組。與空白對照組相比，水提物高劑量組能顯著提高小鼠的睡眠發(fā)生率（p<0.05），其他各組雖然能提高小鼠睡眠發(fā)生率，但是作用效果不顯著（p>0.05）。游秋云等[21]、李明月等[29]采用戊巴比妥鈉協(xié)同催眠實驗也證明了茯苓水提物能明顯增加小鼠睡眠時間、提高小鼠入睡率，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)靜催眠作用。

表4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗Table 4 Subthreshold hypnosis of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

表4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗Table 4 Subthreshold hypnosis of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

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2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

小鼠連續(xù)灌胃不同溶劑提取物30 d，在末次給藥15 min后，腹腔注射巴比妥鈉溶液（劑量為230 mg/kg，注射量為0.2 mL/20 g），記錄各組小鼠睡眠潛伏期的變化。如表5所示，陽性組小鼠睡眠潛伏期最短，其后依次為水提物高劑量組、醇提物高劑量組、多糖高劑量組、水提物低劑量組、醇提物低劑量組和多糖低劑量。與空白對照組相比，水提物高劑量組、醇提物高劑量組、多糖高劑量組和水提物低劑量組均能顯著縮短小鼠進入睡眠的時間（p<0.05），小鼠睡眠潛伏期比空白對照組分別縮短了26.9%、19.3%、11.5%和8.6%，以水提物高劑量組效果最佳，而醇提物低劑量組和多糖低劑量對小鼠睡眠潛伏期的影響不明顯。本實驗結(jié)合以上兩個實驗結(jié)果表明，茯苓不同溶劑提取物改善睡眠作用效果的不同與其所含主要成分不同有關(guān)。現(xiàn)代化學(xué)分析表明，茯苓水提物中包含茯苓多糖和茯苓酸，茯苓醇提物主要成分為茯苓三萜，且茯苓酸屬于茯苓三萜類物質(zhì)[8,30]。上述實驗表明，水提物高劑量組改善小鼠睡眠作用的最佳效果可能與水提物所含有的茯苓酸和多糖的協(xié)同作用有關(guān)。

表5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗Table 5 Sodium barbiturate sleep latency test (±sd, n=10)

表5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗Table 5 Sodium barbiturate sleep latency test (±sd, n=10)

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2.6 茯苓不同溶劑提取物對小鼠腦組織中5-HT、GABA、DA含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，安神類中藥起鎮(zhèn)靜催眠作用機制與睡眠相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和睡眠因子有密切關(guān)系[6]。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它的鎮(zhèn)靜催眠作用主要是通過其與GABA受體（GABAA）特異性結(jié)合而實現(xiàn)的[31]。5-HT是參與睡眠調(diào)節(jié)作用重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)5-HT含量減少會導(dǎo)致動物失眠。DA是一種與睡眠調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，動物腦內(nèi)DA神經(jīng)元興奮會導(dǎo)致警覺性增加、睡眠減少[32]。因此，腦組織中GABA、5-HT與DA含量的變化能一定程度上反映小鼠睡眠質(zhì)量。由表6可知，陽性組小鼠腦組織中5-HT、GABA含量最高（p<0.01），DA含量最低（p<0.01）；與空白對照組相比，水提物高劑量和低劑量組、醇提物高劑量組和多糖高劑量組小鼠腦組織中5-HT、GABA含量表現(xiàn)出不同程度增加，DA含量不同程度降低（p<0.05）。其中水提物高劑量組對小鼠腦組織的5-HT、GABA、DA含量影響最為顯著（p<0.05）。

表6 各組小鼠腦組織中5-HT、GABA、DA的變化比較Table 6 Comparison of changes in 5-HT,GABA and DA in each group of mice brain (±sd, n=10)

表6 各組小鼠腦組織中5-HT、GABA、DA的變化比較Table 6 Comparison of changes in 5-HT,GABA and DA in each group of mice brain (±sd, n=10)

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3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，茯苓不同溶劑提取物對小鼠正常生長無影響；且能不同程度地改善小鼠睡眠情況，增加小鼠睡眠發(fā)生率，延長睡眠時間；升高腦組織中GABA與5-HT含量、降低DA含量。與空白對照組相比，水提物高劑量組效果最佳，其后是醇提物高劑量組、多糖高劑量組、水提物低劑量組、醇提物低劑量組（p<0.05），而多糖低劑量組效果不明顯。茯苓不同溶劑提取物主要成分不同，因此發(fā)揮助睡眠作用效果不同。茯苓水提物助睡眠作用較強，并且多糖是水提物的主要活性成分，說明水提物中多糖發(fā)揮主要作用，不過茯苓水提物改善睡眠的作用機理可能與茯苓多糖和茯苓酸的協(xié)同作用有關(guān)。其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)小鼠腦中的5-HT、GABA、DA含量來發(fā)揮改善睡眠的作用。但茯苓的使用應(yīng)統(tǒng)籌考慮醇提物和水提物的合理配比來達到最佳的助睡眠功效，這需要進一步探索和研究。