謝倩，李慶，李佳楠

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056）（2.武漢云克隆科技股份有限公司，湖北武漢 430056）

日落黃（sunset yellow，SY）是一種水溶性的合成著色劑，由于其顏色均勻性好、穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于食品工業(yè)中[1-4]，然而食品中的SY含量必須嚴(yán)格控制，因?yàn)樗鼤?huì)引起敏感人群的過敏、腹瀉，當(dāng)SY在體內(nèi)積聚時(shí)，會(huì)引起腎臟和肝臟的損害[5]。因此，中國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2011）[6]對(duì)各種食品中的日落黃添加量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。目前，用于測(cè)定食品中日落黃含量的方法眾多，其中《食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB/T 5009.35-2003）[7]中指定的食品中合成著色劑的檢測(cè)方法為薄層色譜法，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35-2016）[8]中用于食品中合成著色劑的檢驗(yàn)方法為高效液相色譜法，前者檢測(cè)方法較快，但準(zhǔn)確度較差，后者靈敏且準(zhǔn)確，但時(shí)效性較差；除此之外，日落黃的檢測(cè)方法還有示波極譜法[9]、近紅外光譜法[10]和紫外分光光度法[11]等，這些方法均無(wú)法兼顧靈敏度和時(shí)效性的要求，因此迫切需要建立新的檢測(cè)體系，對(duì)食品中的日落黃進(jìn)行快速準(zhǔn)確大批量的測(cè)定。

酶聯(lián)免疫法是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與酶的高效催化作用相結(jié)合，發(fā)展建立起來(lái)的一種免疫分析方法[12]。酶聯(lián)免疫法具有操作簡(jiǎn)便、可大批量對(duì)食品樣品進(jìn)行檢測(cè)處理、不需要昂貴的儀器設(shè)備、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前在抗生素殘留、食品獸藥殘留、重金屬污染、農(nóng)藥殘留等方面均有廣泛的應(yīng)用[13-16]。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)食品添加劑一般采用商品化的試劑盒，試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、攜帶方便、檢測(cè)效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，因此日落黃酶聯(lián)免疫試劑盒的研究擁有廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過合成日落黃的人工抗原及制備單克隆抗體，開發(fā)了用于檢測(cè)食品中日落黃的ELISA檢測(cè)試劑盒，并測(cè)試了該試劑盒的檢測(cè)性能和特異性，檢測(cè)了市售水果類制品中的日落黃含量，結(jié)果顯示回收率和精密度均達(dá)到了較高水平，為研究用于測(cè)定食品添加劑的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）：北京政博偉業(yè)生物科技有限公司；N,N'-羰基二咪唑（CDI）、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：美國(guó)Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG：武漢云克隆科技股份有限公司；洗滌緩沖液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS；包被緩沖液（CBS）：0.05 mol/mL，pH 9.6；檢測(cè)溶液A：抗SY單克隆抗體；檢測(cè)稀釋液A（PBS）：0.01 mol/L pH 7.4；檢測(cè)溶液B：辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG；檢測(cè)稀釋液B：0.5% BSA溶液；TMB底物：0.01 g TMB溶解于1 mL二甲亞砜（DMSO）中；封閉液：100 mL PBS中加入1 g OVA；終止液：2 M H2SO4；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)范圍450~630 nm）：武漢云克隆科技股份有限公司；紫外分光光度計(jì)UV2600：日本島津公司；高速離心機(jī)KDC140-HR：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；96孔酶標(biāo)板：美國(guó)Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工抗原合成及鑒定[17,18]

本研究采用羰基二咪唑法合成人工抗原，其中免疫抗原（SY-BSA）的合成方法為：將9 mg日落黃標(biāo)準(zhǔn)品和11.5 mg CDI混勻并溶解于1 mL DMSO中，于25 ℃避光攪拌5 h，而后逐滴加入2 mL濃度為10 mg/mL的BSA溶液中，在室溫下反應(yīng)過夜（約12 h），然后用PBS緩沖液透析人工合成的抗原兩天，期間換液4次；并使用相同的方法合成檢測(cè)抗原（SY-OVA）。真空冷凍干燥透析后的免疫抗原（SY-BSA）和檢測(cè)抗原（SY-OVA），于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

人工合成的抗原使用紫外光譜掃描法進(jìn)行鑒定。使用濃度為0.01 mol/L，pH為7.4的PBS分別配制濃度為0.5 mg/mL的BSA、SY、SY-BSA、SY-OVA溶液，并用PBS進(jìn)行基線調(diào)零，在200~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)以上4種溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，記錄不同波長(zhǎng)下的吸光值，分析數(shù)據(jù)并組合紫外光譜圖，利用組合圖分析SY是否與BSA、OVA偶聯(lián)。

1.2.2 單克隆抗體的制備及純化[19]

初免，將用PBS配成濃度為1 mg/mL的人工抗原（SY-BSA）與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化后采用皮下多點(diǎn)注射免疫的方法免疫6~8周齡的雌性BALB/C小鼠，兩周后進(jìn)行第二次免疫，取1 mg/mL的SY-BSA與弗氏不完全佐劑，乳化后對(duì)進(jìn)行過初免的兩只小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫，經(jīng)過四次免疫和沖擊免疫后的小鼠檢測(cè)其血清效價(jià)，取血清抗體效價(jià)大于9 k小鼠的脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按5:1（數(shù)量配比）比例融合，測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔，對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆，篩選得到能夠穩(wěn)定分泌SY單克隆抗體的細(xì)胞株；BALB/C小鼠腹腔注射滅菌石蠟油，0.5 mL/只，7 d后注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，待小鼠腹部隆起且基本不再變化時(shí)采集腹水，用ProteinG親和層析法進(jìn)行腹水純化，于-20 ℃保存。

1.2.3 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)[20]

采用棋盤滴定法檢測(cè)單克隆抗體的效價(jià)，將450 nm處吸光值在1.0左右時(shí)的稀釋濃度作為抗SY單克隆抗體的工作濃度，酶標(biāo)板依次用濃度為0.125μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL的檢測(cè)抗原（SY-OVA）包被，并通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)。將用包被液稀釋后的包被抗原以每孔100 μL加入到酶標(biāo)板中，4 ℃孵育過夜；棄去孔中液體，每孔加入300 μL PBST洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，5 min后棄去洗滌液，重復(fù)3次；加入用包被液稀釋的1% OVA溶液，37 ℃封閉1 h，然后用PBST洗滌液洗滌3次；每孔加入濃度為100 ng/mL的SY標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，同時(shí)每孔加入用PBS緩沖液倍比稀釋（1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000）的單克隆抗體稀釋液50 μL，37 ℃下反應(yīng)1 h，然后用PBST洗滌液洗滌4次；每孔加入按1:2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）100 μL，37 ℃反應(yīng)40 min，并用PBST洗滌液洗滌5次；每孔加入100 μL TMB，約8 min后，每孔加入50 μL終止液以終止反應(yīng)；在450~630 nm波長(zhǎng)范圍下，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值，以分析抗原（SY-OVA）和抗體的最佳反應(yīng)濃度，同時(shí)分析當(dāng)pH值為5.0~9.0，Na+離子濃度為20~500 mmol/L，以及甲醇溶液濃度為0~30%時(shí)ELISA反應(yīng)的敏感性，以選擇最佳的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)條件。

1.2.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[21-24]

在最佳的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)條件下，縱坐標(biāo)為B/B0值（B是不同濃度SY標(biāo)準(zhǔn)品450 nm處的吸光值；B0為未添加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)450 nm處的吸光值），橫坐標(biāo)為SY標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.4、1.2、3.7、11.1、33.3、100、300 ng/mL）的對(duì)數(shù)值，繪制間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ic-ELISA）標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行相關(guān)性分析。靈敏度用IC50值表示，表示標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)抗原偶聯(lián)時(shí)的半數(shù)抑制濃度；線性范圍代表最大信號(hào)值20%~80%的抑制率（IC20~IC80）；檢測(cè)限由IC10值計(jì)算得出。

1.2.5 交叉反應(yīng)分析[25]

用日落黃檢測(cè)試劑盒檢測(cè)食品中常用的日落黃、酒石黃、胭脂紅和誘惑紅，根據(jù)公式1計(jì)算交叉反應(yīng)率。

1.2.6 日落黃檢測(cè)試劑盒的制備

將檢測(cè)抗原（SY-OVA）用包被液稀釋到終濃度為0.25 μg/mL，并以100 μL/孔包被酶標(biāo)板以制成固相載體。37 ℃ 2 h或者4 ℃過夜；棄去孔中液體并控干，加入用包被液稀釋的濃度為1%的OVA溶液，37℃封閉1 h，PBST洗滌液洗滌3次；控干后密封包裝。試劑盒組成見表1。

表1 日落黃檢測(cè)試劑盒組成Table 1 Compositionofsunsetyellowdetectionkit

1.2.7 日落黃檢測(cè)試劑盒對(duì)市售樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)購(gòu)買經(jīng)HPLC檢測(cè)不含SY的果汁飲料、水果罐頭和果凍樣品，液體樣品直接取樣，固體及半固體樣品進(jìn)行勻漿，將SY標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到以上的樣品中，使終濃度分別為900 ng/mL、300 ng/mL和100 ng/mL，將混合物均質(zhì)混勻。用5 mL PBS浸提3 min，于4 ℃ 10000 r/min下離心10 min，取上清液，使用ic-ELISA法，用日落黃檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)公式2計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工抗原的紫外掃描鑒定

人工抗原通過紫外光譜法鑒定。將BSA、SY、SY-BSA、SY-OVA溶液在200~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果如圖1所示，其中使用半抗原SY與載體蛋白BSA的紫外圖譜作為對(duì)照。由圖1可知，BSA在280 nm處有很強(qiáng)的特征吸收，SY在482 nm處有特征吸收，而SY-BSA在485 nm附近有寬吸收峰，相對(duì)于SY半抗原的吸收峰有所藍(lán)移，說(shuō)明半抗原SY和載體蛋白BSA成功偶聯(lián)。SY-OVA在485 nm處也有寬吸收峰，且相對(duì)于SY半抗原的吸收峰也出現(xiàn)了藍(lán)移，說(shuō)明檢測(cè)抗原SY-OVA也成功合成。

圖1 BSA，SY，SY-OVA和SY-BSA的紫外可見吸收光譜Fig.1 The UV-vis absorption spectra of BSA, SY, SY-OVA and SY-BSA, respectively

2.2 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

將酶標(biāo)板用濃度為0.125 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL的檢測(cè)抗原（SY-OVA）包被，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定純化后的抗體效價(jià)，選取吸光值為1.0時(shí)對(duì)應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的檢測(cè)效價(jià)。棋盤滴定檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)檢測(cè)抗原濃度為0.125 μg/mL時(shí)，抗SY的單克隆抗體效價(jià)為1:32000，而當(dāng)檢測(cè)抗原濃度分別為0.25 μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL時(shí)，抗SY單克隆抗體效價(jià)均可達(dá)1:64000以上，因此，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)的檢測(cè)抗原SY-OVA最佳反應(yīng)濃度為0.25 μg/mL，證明SY單克隆抗體制備成功，同時(shí)也進(jìn)一步證明SY與載體蛋白BSA、OVA成功偶聯(lián)。

圖2 ELISA的棋盤免疫滴定Fig.2 Checkerboard titration of ELISA

同時(shí)，在檢測(cè)抗原濃度為0.25 μg/mL的條件下，分析了pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，Na+離子濃度為20、50、100、200、500 mmol/L以及甲醇濃度為0、5%、10%、20%、30%時(shí)在PBS溶液中間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)的敏感性。IC50代表標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)抗原偶聯(lián)時(shí)的半數(shù)抑制濃度，B0/IC50值是評(píng)價(jià)不同因素對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)靈敏度的重要參數(shù)。圖3最上面的圖顯示，pH值在5.0~9.0范圍內(nèi)升高時(shí)，B0/IC50值先升高后降低，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，B0/IC50值最大；圖3中間的圖顯示，有機(jī)溶劑甲醇對(duì)ELISA反應(yīng)的敏感性有著顯著影響，甚至可抑制抗SY抗體和檢測(cè)抗原SY-OVA的結(jié)合；圖3最下面的圖顯示，Na+濃度為100 mmol/L時(shí)，B0/IC50值最大，當(dāng)Na+濃度升高時(shí)，B0/IC50值顯著降低，表明較高的Na+濃度ELISA反應(yīng)的敏感性有嚴(yán)重影響。綜上所述，ELISA反應(yīng)在pH為7.0、Na+濃度為100 mmol/L，無(wú)有機(jī)溶劑的PBS緩沖液中具有最高的靈敏度，適合在此反應(yīng)條件下來(lái)檢測(cè)樣品和建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 pH值、有機(jī)溶劑和離子強(qiáng)度對(duì)ELISA敏感性的影響Fig.3 Effects of pH value, organicsolvent, and ionicstrength on ELISA sensitivity (n=3)

2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)棋盤滴定法的結(jié)果，將酶標(biāo)板用濃度為0.25 μg/mL的SY-OVA包被，并將SY單克隆抗體以1:32000稀釋上樣，優(yōu)化的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。結(jié)果顯示，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制曲線線性良好，回歸方程式為y=-0.3937x+0.8201（R2=0.9979），IC50值為6.50 ng/mL，經(jīng)計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢測(cè)范圍為62.50~1000 ng/mL，檢測(cè)限為1.50 ng/mL，相比于金一萍[26]文獻(xiàn)中報(bào)道的紫外分光光度計(jì)檢測(cè)日落黃，本研究中的檢測(cè)限1.50 ng/mL顯著低于紫外的檢測(cè)限0.10~0.60 μg/mL，且樣品中的雜質(zhì)對(duì)紫外檢測(cè)的影響較大，易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，而本文所制備的單克隆抗體效價(jià)高、靈敏度高、特異性強(qiáng)，因此可進(jìn)一步用于制備日落黃檢測(cè)試劑盒。

圖4 SY的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The competitive inhibition curve and calibration curve in the line arrange (inset) for SY (n=3)

2.4 交叉反應(yīng)分析結(jié)果

對(duì)抗SY單克隆抗體與SY及其它三種食用色素（酒石黃、胭脂紅、誘惑紅）的交叉反應(yīng)進(jìn)行分析，表2的結(jié)果顯示抗SY單克隆抗體與日落黃的反應(yīng)率為100%，對(duì)誘惑紅有弱交叉反應(yīng)，其交叉反應(yīng)率為2%，推測(cè)是因?yàn)槿章潼S和誘惑紅的分子結(jié)構(gòu)較相似所致；而其對(duì)酒石黃和胭脂紅無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明了制備的日落黃試劑盒對(duì)SY具有較高的特異性，可用于SY的特異性檢測(cè)分析，相關(guān)研究[27]表明高效液相色譜法檢測(cè)日落黃的準(zhǔn)確度及分離度均較高，但由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)及不能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用，而酶聯(lián)免疫法高效、快速及可大批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)使得其非常適合對(duì)食品添加劑等微量物質(zhì)的檢測(cè)。

表2 抗SY抗體與SY及其他食用色素的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivity of anti-SY antibody with SY and other fooddyes

2.5 加標(biāo)樣品SY回收率檢測(cè)

使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)添加了SY標(biāo)準(zhǔn)品的果汁飲料、水果罐頭和果凍樣品中SY含量，計(jì)算出實(shí)際樣品中的SY回收率。結(jié)果顯示SY的回收率和精密度均達(dá)到了較高水平。數(shù)據(jù)結(jié)果如表3所示。

表3 食品樣品中SY含量的回收率分析Table 3 Recovery analysis of the SY spiked in food samples

經(jīng)檢測(cè)分析，SY的批內(nèi)、批間回收率分別為89.18%~101.13%、87.69%~97.90%，且批內(nèi)、批間試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。結(jié)果表明，制備的日落黃檢測(cè)試劑盒對(duì)SY分析的回收率較高，可準(zhǔn)確用于分析樣品中的SY含量；已有文獻(xiàn)[20]報(bào)道用于測(cè)定肉類食品中色素胭脂紅酸的ELISA檢測(cè)試劑盒，此試劑盒加標(biāo)回收率結(jié)果顯示各類樣品的加標(biāo)回收率均較高，且批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差基本小于10%，且HPLC法檢測(cè)與ELISA檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析顯示，兩種檢測(cè)方法在胭脂紅酸的檢測(cè)結(jié)果上具有較高一致性，相關(guān)系數(shù)為0.927，證明ELISA試劑盒用于檢測(cè)食品中的添加劑具有準(zhǔn)確性和普遍性。

3 結(jié)論

合成具有免疫原性的人工抗原是建立食品添加劑免疫分析法的第一步，良好的人工抗原才能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而得到高效的特異性抗體，為后續(xù)研究打好基礎(chǔ)。日落黃屬于小分子物質(zhì)，無(wú)法使機(jī)體產(chǎn)生抗體，本文將日落黃與載體蛋白BSA及OVA偶聯(lián)制備了免疫抗原與檢測(cè)抗原，用SY-BSA免疫小鼠獲得了抗SY單克隆抗體，通過棋盤滴定法測(cè)定了單克隆抗體的效價(jià)達(dá)1:64000以上，同時(shí)探究了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)的最佳條件為pH 7.0、Na+濃度100 mmol/L及無(wú)有機(jī)溶劑的PBS緩沖液，建立了檢測(cè)SY的ic-ELISA方法，其中IC50為6.50 ng/mL，線性范圍為62.50~1000 ng/mL，檢測(cè)限IC10為1.50 ng/mL。本方法具有良好的特異性，除了與誘惑紅有2%的弱交叉反應(yīng)外，與其他兩種色素的交叉反應(yīng)均小于0.01%；通過對(duì)加標(biāo)樣品的SY進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其批內(nèi)、批間回收率分別為89.18%~101.13%、87.69%~97.90%，且批內(nèi)、批間試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說(shuō)明試劑盒檢測(cè)性能和重復(fù)性較好，可用于食品中日落黃的檢測(cè)。本研究通過制備日落黃酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)快速準(zhǔn)確測(cè)定食品中日落黃含量具有重要意義，為食品中違法或超量添加日落黃的監(jiān)督檢驗(yàn)提供了科學(xué)的方法，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。