陳漢金，陳榮橋，朱文信，冼燕萍，侯向昶，吳玉鑾，胡均鵬，劉冬虹，戴航

（廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預警研究中心，廣州市食品安全檢測技術重點實驗室，廣東廣州 511447）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（以下簡稱椰毒假單胞菌）可以分泌毒素米酵菌酸，米酵菌酸具有劇毒性，主要通過抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉位酶(ANT)而產(chǎn)生毒性作用[1-3]，小鼠經(jīng)口LD50為3.16 mg/kg[4-6]，由米酵菌酸引起的食物中毒，致死率可高達40%~100%[7]。我國21世紀初之前發(fā)生的米酵菌酸中毒事件大多集中在酵米面、吊耙漿及發(fā)泡木耳等食品[8-10]，這些食品多為家庭自制。然而，2018年和2020年，廣東省發(fā)生了多起因食用濕米粉及淀粉制品（以下簡稱“濕粉”）引起的米酵菌酸中毒事件[11,12]，造成多人死亡，這些事件相關的濕粉都是來自于食品工業(yè)生產(chǎn)的成品，這種風險的嚴重性引起了社會和監(jiān)管部門的高度重視。

本研究團隊前期圍繞濕粉生產(chǎn)加工過程展開了全方位的風險剖析，通過大量的原料樣品（米、食用淀粉、水、食用油）和生產(chǎn)場所環(huán)境樣品、濕粉樣品的檢測分析，于2020年6月~7月初期間，在濕粉生產(chǎn)的原料碎米和米漿中分離鑒定出椰毒假單胞菌，認為原料碎米為椰毒假單胞菌污染的主要來源，預警了潛在風險[13]。并在1起濕粉污染椰毒假單胞菌事件的2個濕粉樣品和1個原料碎米樣品中分離鑒定出椰毒假單胞菌，通過對菌株的全基因組重測序和構建SNP進化樹進行溯源分析，發(fā)現(xiàn)這3個樣品的菌株具有明顯的聚類，表明濕粉中的椰毒假單胞菌很有可能來源于原料碎米中椰毒假單胞菌的污染。雖然前期研究發(fā)現(xiàn)了主要污染源，但是污染傳遞途徑和傳遞過程還未明晰，因此亟需針對濕粉生產(chǎn)加工過程各環(huán)節(jié)的工藝特點進行風險分析研究，為此類風險防控提供科學的技術支撐。

濕粉的生產(chǎn)工藝主要為：

浸泡洗米過程中如果大米清洗不徹底會帶來污染，浸洗時間過長也可能會滋生細菌。劉壯等[14]研究表明洗米過程會使得菌落總數(shù)增加；白蕓等[15]研究了浸泡米時，低溫（10 ℃）和pH值為2時對細菌總數(shù)和大腸菌群的生長抑制效果最佳；吳軍輝等[16]研究表明調漿是最容易受微生物污染的環(huán)節(jié)。基于發(fā)現(xiàn)污染源來源于原料米，則需從源頭開始，逐一對各工藝環(huán)節(jié)進行研究分析，本文主要針對目前濕粉生產(chǎn)企業(yè)采用的原料米浸泡和清洗工藝方式（據(jù)調研了解，主要為靜態(tài)浸泡和動態(tài)緩慢攪拌清洗方式），在米表面制備椰毒假單胞菌膜，通過2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色技術來表征菌膜的形成，采用實驗室模擬清洗及菌株檢測技術進行研究，闡明該工藝操作是否能有效防控椰毒假單胞菌污染的傳遞。后續(xù)工藝的研究分析將另文介紹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和米

選用前期研究從濕粉成品中分離的椰毒假單胞菌酵米面亞種菌株SZ1進行實驗，該菌株已采用GB/T 4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》[17]和全基因組重測序鑒定為產(chǎn)米酵菌酸的椰毒假單胞菌酵米面亞種。

實驗用米采自濕粉生產(chǎn)企業(yè)，已根據(jù)GB/T 4789.29-2003進行檢測，確定未檢出椰毒假單胞菌酵米面亞種。

1.1.2 儀器與試劑

指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），購自國藥集團化學試劑有限公司；GVC增菌培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，卵黃瓊脂培養(yǎng)基，SS瓊脂培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；VITEK 2 Compact自動微生物快速檢測系統(tǒng)及其鑒定卡，法國梅里埃公司；ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Waters XevoTMTQ MS三重四極桿串聯(lián)質譜儀，Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 米表面菌膜的制備

分別稱取25 g米于2組50 mL離心管（3個離心管/組）中，每組分別標記為S1、S2和S3。在S1和S2中分別加入2 mL濃度為109cfu/L的椰毒假單胞菌菌液，在S3中加入2 mL無菌生理鹽水做參照，再在3個離心管中分別加入2 mL 0.5% TTC指示劑，混合均勻，置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。然后，將S1中的米取出，均勻鋪于培養(yǎng)皿中，于36 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h，干燥，形成干菌膜粘附的米樣品。

1.2.2 浸泡和清洗米

模擬濕粉生產(chǎn)企業(yè)目前普遍采用的靜態(tài)浸泡清洗米（約1 h，換水清洗2次）和緩慢攪拌清洗米（換水清洗2次）的方式進行實驗研究。

靜態(tài)浸泡清洗按如下步驟進行：稱取10 g已覆菌膜的米樣品于50 mL離心管中，加入15 mL無菌鹽水浸泡1 h后收集浸泡液；再用15 mL無菌鹽水分多次沖洗離心管和米，以600 r/min轉速渦旋1 min，收集清洗液；重復用15 mL無菌鹽水再清洗1次，收集清洗液。

緩慢攪拌浸泡清洗按如下步驟進行：稱取10 g已覆菌膜的米樣品于50 mL離心管中，加入15 mL無菌鹽水，以600 r/min轉速渦旋30 min，收集浸泡液；再加入15 mL無菌鹽水，以600 r/min轉速渦旋10 min，收集清洗液；重復用15 mL無菌鹽水再清洗1次，收集清洗液。

1.2.3 洗米水和米樣品中椰毒假單胞菌酵米面亞種的檢測

根據(jù)GB/T 4789.29-2003檢測上述各步驟各段收集的浸洗液、浸洗中脫落的菌膜以及清洗后米樣品中的椰毒假單胞菌。

將毒力實驗培養(yǎng)的椰毒假單胞菌毒素粗提取液，用甲醇-水（1:1，V/V）稀釋適當倍數(shù)后，采用UPLC-MS/MS測定米酵菌酸。檢測色譜條件為：BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序為：0.0~3.0 min，50%~70% A，3.0~3.6 min，70%~95% A，3.6~5.5 min，95% A，5.5~5.6 min，95%~50% A，5.6~7.0 min，50% A；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。質譜條件為：電離方式為電噴霧負離子（ESI-）模式；毛細管電壓2 kV，錐孔電壓10 V；去溶劑溫度500 ℃；去溶劑氣為氮氣，800 L/Hr；錐孔氣為氮氣，50 L/Hr；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM），米酵菌酸和異米酵菌酸的特征離子對（m/z）均為485.3/397.3和485.3/441.3（定量），碰撞能分別為20 eV和10 eV。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗的圖片數(shù)據(jù)均采用Adobe Photoshop進行處理，譜圖數(shù)據(jù)采用origin 8進行處理，米酵菌酸的檢測數(shù)據(jù)采用MassLynx軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 米表面形成菌膜的確認

TTC能夠與活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應生成紅色甲臜，常被用來表征鑒定種子活性[18]、生物體的損傷程度[19]以及用來排除樣品中微生物鑒定的非活性物質干擾[20]，本實驗中借助這一特性來表征米表面形成的生物膜。在米中加入TTC后，由于米表面存在復雜的微生物體系，樣品S1、S2和S3培養(yǎng)72 h后都呈現(xiàn)紅色，但顯色程度略有差異。如圖1所示，S1為經(jīng)干燥處理后覆椰毒假單胞菌菌膜米的形貌圖，呈明顯暗紅褐色；S2為未經(jīng)干燥處理的表面濕潤的覆椰毒假單胞菌菌膜米的形貌圖，略呈暗紅褐色；S3為空白對照，略呈較鮮明的紅色，應為其他細菌與TTC作用顯色。根據(jù)TTC的顯色原理，表明米表面確實形成了一定程度的菌膜，尤其是米的側角等不平整之處（如圖1中的黑圈部位）。通過GB/T 4789.29-2003檢測，在樣品S1和S2中檢出椰毒假單胞菌，在樣品S3中未檢出椰毒假單胞菌，表明所制備的覆菌膜米樣品可以用于后續(xù)試驗研究。

圖1 樣品S1、S2和S3覆菌膜培養(yǎng)72 h的形貌圖Fig.1 Graph of sample S1, S2 and S3 cultured 72 h

2.2 浸泡和清洗米過程的外觀變化

據(jù)調研了解，濕粉生產(chǎn)企業(yè)采用常溫浸泡和清洗米，基于成本考慮，避免米粒之間或米與容器之間因大力摩擦作用掉渣而造成損失，所以一般采用靜態(tài)浸泡清洗或緩慢攪拌浸泡清洗方式，加水量一般為高于米表面10~15 cm左右，主要除去米中一些質輕易漂浮在水面的雜質或一些小沙石雜質。靜態(tài)浸泡清洗方式的浸泡時間一般約為40 min~1 h，然后通過泵抽上攪拌罐，緩慢攪拌、過水式清洗2次。緩慢攪拌浸泡清洗方式一般為連續(xù)緩慢攪拌約1 h，期間換水清洗2次。

本實驗采用浸泡清洗1 h，換水清洗2次進行研究，圖2顯示了樣品S1浸洗3次的實驗觀測結果。從外觀上觀察，靜態(tài)浸洗和動態(tài)緩慢攪拌浸洗都能在一定程度上清除部分米上的微生物，表現(xiàn)為浸洗液顯紅色和渾濁，緩慢攪拌的浸洗液會比靜態(tài)浸洗更渾濁，且緩慢攪拌的3次浸洗液中都有懸浮紅色片狀生物膜（圖2中箭頭指向部分），而靜態(tài)浸洗液中幾乎沒有紅色片狀生物膜；靜態(tài)浸洗3次后，米局部還可見較多類似片狀的菌膜存在（圖2中放大部位），而緩慢攪拌后的米樣品中這種片狀菌膜相對減少更多，這說明緩慢攪拌浸洗比靜態(tài)浸洗可清洗掉更多的污染物質，這是由于攪拌動力促進了米粒之間以及米粒與容器之間的摩擦，加大了菌膜的清除效果。樣品S2和S3浸洗過程的顏色變化與S1類似。但是，對于干燥菌膜的米和濕潤菌膜的米，由于米表面不光滑、形狀不規(guī)整，即使在緩慢攪拌作用力下，也不能將菌膜完全洗去，在米的邊角部位仍可見紅褐色的菌膜。

圖2 樣品S1在兩種浸洗方式下的變化Fig.2 The variation of sample S1 rinsed by 2 ways

2.3 椰毒假單胞菌酵米面亞種鑒定

按照GB/T 4789.29-2003方法，對2種浸洗方式收集到的各次浸洗液、浸洗中脫落的菌膜以及清洗后的米樣品檢測椰毒假單胞菌。樣品先在增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，再在PDA平板上劃線培養(yǎng)后，細菌形貌圖如圖3所示（圖中上層為樣品S1緩慢攪拌清洗后的實驗圖，下層為樣品S1靜態(tài)浸洗后的實驗圖）。可在PDA平板中觀察到典型的椰毒假單胞菌酵米面亞種菌落，表現(xiàn)為表面濕潤、呈乳白色、中心有些許凸起、邊緣整齊且光滑等（如圖3中黑圈所示），符合GB/T 4789.29-2003描述。在樣品S2對應的浸洗液、浸洗中脫落的菌膜以及清洗后的米樣品中也均可以觀測到符合GB/T 4789.29-2003描述的典型的椰毒假單胞菌酵米面亞種菌落；但在對照樣品S3對應的浸洗液及清洗后的米樣品中均未發(fā)現(xiàn)典型的椰毒假單胞菌酵米面亞種菌落。

圖3 S1浸泡液和浸洗米樣品PDA平板疑似菌落形貌Fig.3 Suspected colony morphology on PDA of S1 soaking water and soaking rice

按照GB/T 4789.29-2003，對上述典型椰毒假單胞菌酵米面亞種菌落進一步鑒定，但是由于椰毒假單胞菌目前還沒有成熟的定量檢測方法，本實驗只能進行定性研究。在卵黃瓊脂平板培養(yǎng)48 h后呈現(xiàn)的菌落特征如圖4所示，菌落表面光滑濕潤，周圍有乳白色圓環(huán)，在光照斜射下呈虹彩色，而在SS瓊脂培養(yǎng)基中均未見生長，這明顯符合椰毒假單胞菌酵米面亞種的特征。進一步用VITEK 2 Compact進行菌株鑒定以及進行毒力實驗，結果確認均為椰毒假單胞菌酵米面亞種（實驗對應小白鼠經(jīng)口灌胃0.5 mL粗毒素后24 h內(nèi)均死亡，米酵菌酸的檢測譜圖如圖5所示）。在樣品S1和S2的3次浸洗液、浸洗中脫落的菌膜以及浸洗后米樣品中均檢出椰毒假單胞菌酵米面亞種，證明了菌膜中的確含有椰毒假單胞菌，同時也表明通過浸泡清洗可以洗去部分椰毒假單胞菌酵米面亞種，但是并不能完全將污染菌清洗掉，即不能完全防控這種污染風險向下一生產(chǎn)環(huán)節(jié)傳遞。在前期研究的采自濕粉生產(chǎn)企業(yè)的米漿樣品中檢出椰毒假單胞菌酵米面亞種和米酵菌酸也證實了這個風險傳遞的可能性[10]。

圖4 PDA中典型菌落對應的卵黃平板上菌株特征形貌Fig.4 The morphology of the strain on the Egg Yolk Agar Base corresponding to the typical colony in PDA

圖5 米酵菌酸標準液（a）、動態(tài)浸洗米中分離菌株粗毒素（b）和靜態(tài)浸洗米中提取菌株粗毒素（c）離子提取譜圖Fig.5 Extraction ion chromatograms of bongkrekic acid standard solution (a), toxin of strain identified from dynamic rinsed rice (b), toxin of strain identified from static rinsed rice(c)

3 結論

3.1 原料米受到椰毒假單胞菌微生物污染后，在潮濕等適宜條件下可能會大量繁殖，并可能通過自身分泌物或共存的其他細菌的分泌物包裹在米表面，形成菌膜，尤其是在米表面較粗糙或死角部位易形成與米粘附較緊密的菌膜。本研究表明，椰毒假單胞菌可以參與米表面的菌膜生成，如果原料米已受到椰毒假單胞菌的污染，雖然靜態(tài)浸洗和緩慢攪拌浸洗方式都無法保證徹底防控該污染的傳遞，但都可以在一定程度上消減該污染風險，且加大摩擦作用力對風險消減效果會更好。因此，建議濕粉生產(chǎn)企業(yè)嚴格落實原料米的進貨查驗制度和貯存制度，按照先進先出的原則使用，并加快周轉，避免長時間存放，防止交叉污染；建議把浸洗米工序列為關鍵控制點，生產(chǎn)時必須嚴格執(zhí)行浸洗米操作并做好記錄，以降低相關風險，切莫為了控制成本而偷工減料。

3.2 另外，在企業(yè)調研時發(fā)現(xiàn)，濕粉生產(chǎn)行業(yè)通常為不連續(xù)生產(chǎn)，一般每天只生產(chǎn)6~8 h，不生產(chǎn)時浸洗米容器常見有積水和少量米殘留，如果其中有椰毒假單胞菌殘留，則可能容易大量繁殖，對下一班次生產(chǎn)造成污染，鑒于椰毒假單胞菌是條件致病菌，其最佳生長溫度約為36 ℃，最佳產(chǎn)毒素米酵菌酸的溫度約為26 ℃，而且要繁殖達到一定的細菌量才有可能在短時間內(nèi)產(chǎn)生致死量的毒素，因此建議在班后加強對容器的清洗，保持容器潔凈、干燥，并定期進行殺菌消毒，進一步降低風險。