蔡升 楊平 續(xù)晨 蔡小寧

摘要：用1對(duì)通用引物對(duì)采集自湖北省恩施市魚塘壩獨(dú)特富硒礦床土壤上的壺瓶碎米薺葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，獲得了長度為852 bp的包含核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列。將獲得的多條碎米薺屬不同物種的核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，拼接出“基準(zhǔn)”序列，然后再比較不同物種核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列與“基準(zhǔn)”序列的堿基差異。結(jié)果表明，壺瓶碎米薺與“基準(zhǔn)”序列相比，堿基差異最多，達(dá)到17處，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過同屬其他物種與“基準(zhǔn)”序列的堿基差異，是平均數(shù)的3.3倍。據(jù)此推測，某種碎米薺長期生長于恩施市富硒地區(qū)，產(chǎn)生了能夠適應(yīng)高含量硒土壤逆境的遺傳變異，形成了超強(qiáng)富硒的能力，進(jìn)化出了壺瓶碎米薺這一新物種，從而提出了壺瓶碎米薺在高含量硒土壤逆境中加速進(jìn)化假說。

關(guān)鍵詞：壺瓶碎米薺;硒;核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū);遺傳;進(jìn)化;假說

中圖分類號(hào)： Q755;S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0048-04

壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis）是一種超富硒植物，能夠忍耐土壤中高含量的硒，并能在體內(nèi)大量積累。Yuan等測得壺瓶碎米薺葉片中硒含量可達(dá)1 965 mg/kg（干質(zhì)量）[1];Shao等測得壺瓶碎米薺葉片中硒的含量為1 427 mg/kg（干質(zhì)量）[2]。能夠積累如此高含量的硒，說明壺瓶碎米薺具有獨(dú)特的富硒機(jī)制，對(duì)其富硒的生理生化和分子機(jī)制開展研究，揭示富硒的科學(xué)原理，將有助于對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中硒含量進(jìn)行調(diào)控，獲得更多有益于健康的農(nóng)產(chǎn)品，以造福于人類。

以往通過傳統(tǒng)的分類學(xué)方法鑒定從野外采集的壺瓶碎米薺種質(zhì)資源，對(duì)鑒定人的專業(yè)要求較高，經(jīng)驗(yàn)不足就可能誤采。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家已經(jīng)研究出條形碼識(shí)別技術(shù)，例如通過測定植物的核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS）來對(duì)物種進(jìn)行鑒定，為廣大科技人員提供了便利[3]。

本試驗(yàn)中，擬對(duì)采集自湖北省恩施土家族苗族自治州（恩施州）魚塘壩獨(dú)特富硒礦床土壤中生長的壺瓶碎米薺提取DNA，用通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增其核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，獲得相應(yīng)的參考序列，為今后準(zhǔn)確鑒定壺瓶碎米薺種質(zhì)資源打下基礎(chǔ)，同時(shí)為今后進(jìn)一步研究壺瓶碎米薺超常富硒能力的分子機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2020年8月將從湖北省恩施州新塘鄉(xiāng)雙河社區(qū)魚塘壩富硒土壤中采集的壺瓶碎米薺植株移栽于南京曉莊學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的盆缽中，待其生長3個(gè)月后，取新鮮嫩葉提取DNA。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取采用北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)的DN14試劑盒;PCR擴(kuò)增采用北京艾德萊生物有限公司生產(chǎn)的2×F8 FastLong PCR Master Mix，復(fù)性溫度為56 ℃，72 ℃延伸時(shí)間為10 s。

1.3 選用的引物序列

引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物代號(hào)、位置和詳細(xì)序列見表1。

1.3 PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后，交由南京擎科生物科技有限公司測序，DNA測序峰圖用Chromas軟件顯示。

1.4 序列分析

將測序獲得的序列去除兩端測序質(zhì)量較差的部分，然后用Contigexpress 軟件進(jìn)行拼接;登錄NCBI網(wǎng)站獲取所需要的其他碎米薺物種的含ITS的序列;用Lasergene 7.1的子軟件SeqMan 分析各種碎米薺物種ITS序列的變異;用ClustalX 1.83和MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 壺瓶碎米薺ITS序列的獲得

采用引物ITC-5和引物ITC-3組合（引物序列見表1）對(duì)壺瓶碎米薺核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長度約900 bp的DNA產(chǎn)物，圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果。

然后以同樣的引物對(duì)PCR產(chǎn)物測序，獲得了原始的DNA序列（圖2），對(duì)獲得的這些序列去除兩端不可靠序列，用Contigexpress軟件進(jìn)行拼接，獲得了長度為852 bp的DNA序列，包含部分的18S基因、完全的ITS1（核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1）、完全的 5.8S 基因、完全的ITS2（核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2）、部分的28S基因的DNA序列，已經(jīng)提交GenBank，序列登錄號(hào)（ID）為MW282045。

2.2 不同物種間ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將所獲得的壺瓶碎米薺的ITS序列和其他碎米薺物種的ITS序列用ClustalX 1.83軟件和MEGA 6軟件鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以擬南芥（Arabidopsis thaliana）的ITS序列（登錄號(hào)：AJ232900）為參照，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，明顯可以分為3個(gè)聚類，Cardamine digitata （登錄號(hào)：EU819328，下同）、Cardamine purpurea（EU819358）、Cardamine blaisdellii（EU819312）、Cardamine pedata （EU819356）、Cardamine umbellata（EU819379）、Cardamine victoris （EU819382）、Cardamine nuttallii （EU819350）、Cardamine rupicola （EU819368）、大葉碎米薺[Cardamine macrophylla（EU819344）]聚為一

類;Cardamine amporitana （AY260598）、大碎米薺[Cardamine amara（KF988052）]、碎米薺[Cardamine hirsuta（MH808258）]、彎曲碎米薺[Cardamine flexuosa（DQ268409）]、圓齒碎米薺[Cardamine scutata（DQ268475）]、Cardamine niigatensis （DQ268493）、Cardamine clematitis（EU819318）聚為一類;壺瓶碎米薺[Cardamine hupingshanensis（MW282045）]單獨(dú)聚為一類，與其他碎米薺物種遺傳距離最遠(yuǎn)。

2.3 不同碎米薺物種ITS序列的比較分析

為進(jìn)一步分析比較壺瓶碎米薺和其他碎米薺物種進(jìn)化過程中產(chǎn)生的變異大小，將這些ITS序列用Lasergene的子軟件SeqMan進(jìn)行拼接，得到一個(gè)“基準(zhǔn)”的包含ITS1序列、5.8S基因序列和ITS2序列的長度為617 bp的DNA序列（圖4）。然后將各個(gè)碎米薺物種的ITS1序列和ITS2序列與“基準(zhǔn)”序列進(jìn)行比較，考察在對(duì)應(yīng)位置的堿基變異情況。

由表2可知，與“基準(zhǔn)”序列相比，每條序列的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)平均有5.2個(gè)變異，變異最少的物種是Cardamine digitata，只有2處發(fā)生了變異;變異最多的是壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis ），有17處發(fā)生了變異，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過平均水平，是平均數(shù)的3.3倍，與變異第2多的Cardamine niigatensis相比，變異數(shù)也達(dá)到了它的2.1倍。

3 討論與結(jié)論

壺瓶碎米薺具有驚人的耐硒和聚集硒的能力，即使在全球唯一沉積型的獨(dú)立硒礦床——恩施市漁塘壩硒礦床的土壤中也能生長良好[4-6]，顯然有其獨(dú)特的遺傳特性。從前述的分析可知，壺瓶碎米薺與其同屬的其他物種相比，在核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列上的差異很大，表明其進(jìn)化速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過同類物種，而其他物種的耐硒聚硒能力遠(yuǎn)低于壺瓶碎米薺。因此推測，最初某種原始的碎米薺生長于恩施市富硒土壤上，經(jīng)受了長期的高硒環(huán)境壓力，遺傳基因產(chǎn)生了很多突變，經(jīng)過若干年的選擇，那些能夠耐受高含量硒土壤逆境的突變個(gè)體及其后代存活了下來并繁衍至今，從而進(jìn)化成新物種——壺瓶碎米薺[7]。也就是說，高含量硒土壤環(huán)境加速了壺瓶碎米薺的遺傳進(jìn)化，造成其遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于同屬其他物種的DNA序列的變異。今后進(jìn)一步的研究工作，可以找出耐受和富集硒的相關(guān)基因，研究其功能和作用機(jī)制。還可以對(duì)多種碎米薺物種的基因進(jìn)行橫向比較，研究耐受和富集硒相關(guān)基因的進(jìn)化路徑。

此外，筆者先建立“基準(zhǔn)”序列，然后再與其比較DNA堿基的變異情況，可以很直觀地觀察到物種的進(jìn)化速度，該方法可應(yīng)用到同類研究上。如果能編制出對(duì)應(yīng)的軟件，則可以大大提高效率。

在本試驗(yàn)中，筆者對(duì)取自恩施市魚塘壩獨(dú)特富硒礦床土壤上生長的壺瓶碎米薺DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，得到了壺瓶碎米薺核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，為其分子鑒定提供了參考序列。本試驗(yàn)所選用的引物擴(kuò)增出來的條帶特異性好，幾個(gè)獨(dú)立的PCR產(chǎn)物雙向測序獲得的序列在去除了兩端的部分序列后，重復(fù)性很好，因此建立了有效的壺瓶碎米薺分子鑒定方法。

參考文獻(xiàn)：

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[3]Chen S L，Yao H，Han J P，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS One，2010，5（1）：e8613.

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