欽 鵬，陳薇蘭，王 淏，李仕貴

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，成都 611130）

基因組結(jié)構(gòu)變異（SVs）和基因拷貝數(shù)變異（gCNVs）作為重要的遺傳變異來源，越來越多的證據(jù)表明SV和gCNV在調(diào)控動植物表型多樣性方面具有重要作用[1-2]。但基于短片段測序數(shù)據(jù)的SV和gCNV鑒定困難且不可靠[3]。即使利用長片段測序數(shù)據(jù)，仍然很難解決位于重復(fù)區(qū)域附近或非常大的SV[4]。近年來，由于高質(zhì)量基因組組裝方法的快速發(fā)展，越來越多研究利用高質(zhì)量組來鑒定和分析SV[5-10]。但目前相關(guān)研究僅限于少數(shù)材料，少有利用群體水平的高質(zhì)量基因組來研究SV，因此植物基因組的SV和gCNV變異情況仍不清楚。水稻作為世界上最重要的糧食作物和植物研究的模式生物，到目前為止，僅有利用短片段測序數(shù)據(jù)鑒定的SV結(jié)果[11-15]，還未有群體水平上對水稻SV和gCNV全面準(zhǔn)確的研究報道。

研究人員選取了遺傳背景具有高度代表性的33個水稻材料，包括亞洲栽培稻各亞群代表性材料和非洲栽培稻材料，以及水稻生產(chǎn)和育種上廣泛使用的優(yōu)良品種和核心親本材料。利用長片段測序和NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得了31份材料平均深度～60倍的長片段序列數(shù)據(jù)。利用高質(zhì)量基因組組裝和注釋流程，獲得了31個均達(dá)到參考基因組水平的高質(zhì)量基因組和基因注釋。結(jié)合已發(fā)表的兩個高質(zhì)量基因組（日本晴和蜀恢498）和注釋結(jié)果，構(gòu)建了一個含66 636個基因的泛基因組。通過32個材料與日本晴基因組序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)平均每個材料相對日本晴存在24 469個SVs，通過去冗余，共獲得171 072個相對于日本晴基因組的非冗余SVs，并應(yīng)用多種方法證明了鑒定到的SV具有較高的準(zhǔn)確性。通過與已報道的SV比較分析，發(fā)現(xiàn)其中82.8%的SV未在先前基于短序列測序數(shù)據(jù)得到的SV中鑒定到。進(jìn)一步對SV在基因組上分布的分析發(fā)現(xiàn)，SV在染色體上非均勻分布，存在140個SV熱點(diǎn)區(qū)域。

研究人員進(jìn)一步利用非洲栽培稻CG14作為外群，對亞洲栽培稻群體中SV序列的祖先型進(jìn)行了推斷，共對130 862個SV祖先型進(jìn)行了推斷，并將明確發(fā)生在亞洲栽培稻中的SVs定義為dSVs（derivedstate SVs）。對dSV相對基因位置的分析發(fā)現(xiàn)，53.2%的dSV位于基因附近（包括基因上下游2 kbp區(qū)域），其中大多數(shù)位于基因的非編碼區(qū)且發(fā)生在較少材料中?；诨虻姆夯蚪M中～50%（32 668）的基因上下游2 kbp區(qū)域在32個亞洲栽培稻種至少有一個dSV，其中包括1 406個已經(jīng)報道的基因。這些dSVs對揭示亞洲栽培稻中自然選擇和人工馴化過程導(dǎo)致基因組結(jié)構(gòu)性變異的方向和生物學(xué)意義具有重要作用。例如先前報道的兩個與獨(dú)腳金內(nèi)酯合成相關(guān)基因SLB1和SLB2被認(rèn)為是在秈稻群體中缺失與優(yōu)良性狀（分蘗增加和獨(dú)腳金萌發(fā)降低）相關(guān)而被人工選擇到[16]，本研究結(jié)合該SV的分化狀態(tài)和群體分布等分析發(fā)現(xiàn)，很可能是在粳稻中進(jìn)化或馴化過程中被插入含有SLB1和SLB2基因的基因組序列，因為其可能幫助磷的吸收提高產(chǎn)量從而被保留在粳稻中。

因為筆者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)SV位于非編碼區(qū)，研究人員進(jìn)一步利用蜀恢527材料中存在與不存在SV的基因，分析了SV對基因表達(dá)量的影響。通過分析多份不同脅迫處理和不同發(fā)育時期的蜀恢527轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在整體表達(dá)水平上，附近存在SV的基因的表達(dá)量低于不存在SV的基因的表達(dá)量，且附近存在SV的基因的表達(dá)量對環(huán)境脅迫更敏感。利用33份材料苗期地上和地下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)3 340個SV在地上或地下組織中與基因表達(dá)量顯著相關(guān)，表明SVs在水稻進(jìn)化和馴化過程中對基因表達(dá)模式有著廣泛的影響。研究人員進(jìn)一步分析了dSVs在亞洲栽培稻各個亞群中的分布，發(fā)現(xiàn)在可用于分析群體分布的20 965個dSV中，25.7%的dSVs被特異性地固定在一個或多個亞群中，暗示大量dSVs可能受到自然或人工選擇并保留在相應(yīng)的群體中。

研究人員利用泛基因組中基因的蛋白序列比對到33個基因組序列的策略鑒定分析gCNV，發(fā)現(xiàn)大量（25 549）基因在33個材料間存在基因序列拷貝數(shù)變異（gCNV），包括2 945個非洲栽培稻CG14特異的gCNVs，22 604個栽培稻中特異的gCNVs。結(jié)合33份材料苗期的地上和地下組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，296和361個基因的拷貝數(shù)變異和表達(dá)量在之間存在顯著地相關(guān)性。這些之前研究未發(fā)現(xiàn)大量具有g(shù)CNV的基因?qū)⒓铀賰?yōu)異自然等位變異的挖掘，比如OsVIL1在N22等7個材料中存在2個拷貝，且與表達(dá)量顯著正相關(guān)。結(jié)合OsVIL1過表達(dá)能提高穗粒數(shù)[17]，因此該2個拷貝很可能具有增加水稻穗粒數(shù)的功能。大量具有g(shù)CNV基因的鑒定也將有利于加快挖掘復(fù)雜區(qū)域中控制農(nóng)藝性狀多態(tài)性的基因組變異和應(yīng)用，如之前報道的越光中早花QTL（qDTH7-3）[18]，我們發(fā)現(xiàn)OsMADS18兩個拷貝位于該區(qū)段，結(jié)合OsMADS18過表達(dá)的早花表型[19-20]推斷OsMADS18兩個拷貝很可能是控制該早花QTL的目標(biāo)變異。

結(jié)合人類分析SV形成機(jī)制的流程，研究人員系統(tǒng)地分析了水稻中SV形成機(jī)制。發(fā)現(xiàn)水稻SV主要由TEI（轉(zhuǎn)座子插入）和NHEJ（非同源末端連接）兩種機(jī)制形成。但對于不同類型的SV，主要的形成機(jī)制有所不同，比如缺失和插入分別主要由NHEJ和TEI形成。結(jié)合SV邊界序列與TE注釋，研究人員發(fā)現(xiàn)73.2%的由NHEJ和NAHR（非等位同源重組）機(jī)制形成的SV的邊界都具有TE序列。同時相比全基因組LTR的比例，NHEJ和NAHR產(chǎn)生的SV斷點(diǎn)兩端具有更高比例的LTR。這些結(jié)果表明TE，特別是LTR能更高頻率產(chǎn)生DNA斷裂為NHEJ形成SV提供可能，以及LTR能更高頻率提供同源序列為NAHR產(chǎn)生SV提供可能。

研究人員進(jìn)一步利用所鑒定到的PAV（presence and absence variation）和 variation graph toolkit流程，首次構(gòu)建了水稻圖形基因組。結(jié)合674份水稻材料的二代短序列測序數(shù)據(jù)和圖形基因組共鑒定到47 952個PAV。與674份材料的SNP數(shù)據(jù)連鎖分析發(fā)現(xiàn)，17.5%的SV表現(xiàn)出與其附近SNP非常低的連鎖度，表明這些基因組變異不能被SNP代表。利用674份材料的葉片早衰表型和SNP、SV數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析發(fā)現(xiàn)，最顯著相關(guān)的位點(diǎn)只能被SV檢測到。該SV位于Os06g13470基因啟動子區(qū)域，表達(dá)量分析結(jié)果表明該SV可能特異性在灌漿期激活Os06g13470的表達(dá)，暗示該SV很可能是控制葉片早衰的候選變異位點(diǎn)。這些結(jié)果表明：在研究自然變異調(diào)控農(nóng)藝性狀多態(tài)性方面，圖形基因組和SV具有SNP與線性參考基因組難以代替的作用。研究人員進(jìn)一步搭建了包含基因組序列和基因組變異的數(shù)據(jù)庫RiceRC.Com。本研究內(nèi)容（圖1）為水稻及其他作物功能基因組研究、優(yōu)良等位基因挖掘和功能解析、分子設(shè)計育種奠定了堅實基礎(chǔ)。

圖1 本研究相關(guān)的主要內(nèi)容Figure 1 This topic research primary coverage