張維偉，趙福永

（1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025；2.利川市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,湖北 恩施 445400）

銀杏是一種重要的多用途經(jīng)濟林木，其葉富含黃酮類化合物，葉提取物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等行業(yè)［1-4］。銀杏幼苗在生長發(fā)育過程中，其幼嫩根莖易受到以蠐螬為主的地下害蟲的啃食，造成根莖受損，甚至腐爛，嚴(yán)重影響水分及養(yǎng)分運輸，從而導(dǎo)致植株落葉早或萎黃，甚至死亡，不利于銀杏的規(guī)?；N植。蠐螬是金龜子類幼蟲的總稱，其防治方法主要有化學(xué)防治、物理防治及生物防治等，而生物防治因防治效果好、成本低、環(huán)保等優(yōu)點，具有極大的推廣應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外的生物防治主要是利用昆蟲病原線蟲的侵染致病、致死作用。昆蟲病原線蟲是一類專門寄生于昆蟲體內(nèi)的線蟲，可釋放共生菌使昆蟲患敗血癥而死亡，不污染環(huán)境，且對人畜安全，可用于蠐螬等害蟲的防治［5］。

國外內(nèi)已有較多使用昆蟲病原線蟲防治蠐螬的研究與報道。李根等［6］對5 個昆蟲病原線蟲種類對小地老虎致病力的比較研究發(fā)現(xiàn)，斯氏線蟲對小地老虎致死速度最快，侵染72 h 后的死亡率為86.7%，96 h 后的死亡率達(dá)100%。武海斌等［7］利用嗜菌異小桿線蟲H06 在花生結(jié)莢期施用，對蠐螬的防治效果達(dá)80.78%。Ansari［8］和李小峰［9］分別研究了S.feltiae對鞘翅目害蟲的防治有較好效果。張中潤［10］等研究發(fā)現(xiàn)，S.longicaudum對高爾夫球場的蠐螬具有較好的防治效果。然而，截止目前，國內(nèi)還未見有利用昆蟲病原線蟲防治銀杏蠐螬的相關(guān)報道。

本研究從恩施地區(qū)銀杏種植區(qū)土壤中分離獲得了2 種昆蟲病原線蟲，并探討了其在不同條件下對銀杏蠐螬的致病性，為后期利用昆蟲病原線蟲防治銀杏蠐螬技術(shù)及生物防治制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 昆蟲病原線蟲的分離與鑒定

1.1.1 土樣采集

2018 年7 月和10 月，用土樣采集器在利川林業(yè)局甘溪山銀杏GAP 基地采集了表層土以下10～20 cm的土樣，采集地土壤質(zhì)地以壤土為主，共計30 份，每份1 kg 左右。土樣混合均勻后用密封袋封裝并帶回實驗室，常溫保存。

1.1.2 昆蟲病原線蟲的誘集

參考White［11］和Bedding 等［12］方法，利用大蠟螟作為活體寄主誘集土樣中的昆蟲病原線蟲。具體操作步驟為：每份土樣取200 g 裝進(jìn)塑料盒（長15 cm，寬8 cm，高3.5 cm）中，每塑料盒中放入5 頭大蠟螟末齡幼蟲，然后置于20～25 ℃的條件下。5 d 后收集大蠟螟尸體，并將蟲尸轉(zhuǎn)至線蟲收集盤收集昆蟲病原線蟲的侵染期幼蟲，每份土樣誘集3 次。

1.1.3 昆蟲病原線蟲的純化、保存與鑒定

將收集到的侵染期幼蟲倒入200 mL 燒杯中，加入適量滅菌水，靜置30 min；去除上層水，重復(fù)4～5 次，直至水變清澈。將凈化后的幼蟲懸浮液置于8～12 ℃保存。每隔3個月用大蠟螟末齡幼蟲重新繁殖一次線蟲［13］。

采用大蠟螟末齡幼蟲對誘集到的昆蟲病原線蟲進(jìn)行活體繁殖后，按照下列步驟和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。待大蠟螟死后第3～4 d解剖尸體，收集成蟲［14］；然后在60 ℃Ring 溶液中浸泡3 min 殺死待測成蟲，并用FA 固定液固定［15］；選取約30 只待測成蟲，在顯微鏡下進(jìn)行觀測，參照Hominick 等［16］報道的參數(shù)確定線蟲種類。

1.2 致病性昆蟲病原線蟲的篩選

1.2.1 供試蟲源

供試線蟲為本試驗通過大蠟螟末齡幼蟲誘集并純化所獲得。供試金龜子幼蟲均為本實驗室于2019年5 月—7 月間在利川林業(yè)局甘溪山銀杏GAP 基地誘捕獲的銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜成蟲經(jīng)飼養(yǎng)獲得。飼養(yǎng)方法：成蟲產(chǎn)卵后，將卵放置到裝有15%左右濕度土壤的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃恒溫箱中孵化，待卵孵化后，將幼蟲置于15%～18%濕度土壤的牙簽盒中，25℃環(huán)境下飼養(yǎng)，以馬鈴薯塊為飼料，飼養(yǎng)至所需齡期備用，為保證飼養(yǎng)條件穩(wěn)定，每隔20 d 左右對土壤和飼料進(jìn)行更換。

1.2.2 昆蟲病原線蟲懸浮液制備

取昆蟲病原線蟲溶于一定量蒸餾水（如100 mL）中，用磁力攪拌器攪拌均勻后取1 mL 懸浮液進(jìn)行計數(shù)，以5 次觀測的平均值計算昆蟲病原線蟲懸浮液濃度。用蒸餾水調(diào)整線蟲懸浮液終濃度至500 IJs/mL，置于8～12 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 致病性線蟲篩選

分別將20 頭金龜子1 齡幼蟲和若干0.5 cm3大小的馬鈴薯塊置于牙簽盒（直徑4 cm，高8 cm，下同）底，并加入滅菌壤土（含水量為18%，過40 目篩，下同）50 g，最后滴加濃度為500 IJs/mL 的線蟲懸浮液40 μL，以滴加等量無菌水作為對照。每處理重復(fù)3 次。為保證空氣流通，牙簽盒密封后在盒蓋上留小孔，同時各處理置于同一恒溫箱中，溫度為25 ℃、相對濕度為80%。分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查蠐螬的死亡情況并計算校正死亡率。

1.3 昆蟲病原線蟲對銀杏蠐螬的致病力測定

1.3.1 供試蟲源

選取1.2 中篩選得到的致病力較強的昆蟲病原線蟲進(jìn)行致病力測定，供試蠐螬為2019 年5 月—7 月間在利川林業(yè)局甘溪山銀杏GAP 基地誘捕獲得。

1.3.2 不同劑量的昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×?/p>

將500 IJs/mL 的線蟲懸浮液稀釋成400 IJs/mL、300 IJs/mL、200 IJs/mL 和100 IJs/mL 等4 個濃度，以滴加無菌水作為對照，共5 個處理組，各取40 μL 線蟲懸浮液稀釋分別加入到裝有20 頭金龜子1 齡幼蟲的牙簽盒（內(nèi)含馬鈴薯塊和滅菌土，同1.2.3）內(nèi)，每處理重復(fù)3 次。將各處理置于同一恒溫箱中，溫度為25 ℃、相對濕度為80%。分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查記錄蠐螬死亡情況并計算死亡率。

1.3.3 不同溫度下昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×?/p>

根據(jù)1.3.2 試驗結(jié)果，取6 個均含有20 頭銅綠麗金龜1 齡期幼蟲、馬鈴薯塊及50 g 滅菌土（含水量為18%）的牙簽盒，將40 μL 濃度為300 IJs/mL的線蟲懸浮液滴加各牙簽盒（牙簽盒的處理同1.2.3） 中，每處理重復(fù)3 次，各處理分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，恒溫箱濕度均為80%，分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查記錄蠐螬死亡情況并計算死亡率。

1.3.4 不同土壤濕度下昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×?/p>

根據(jù)1.3.3 試驗結(jié)果，取5 個均含有20 頭銅綠麗金龜1 齡期幼蟲、馬鈴薯塊及50 g 滅菌土的牙簽盒，將40 μL 濃度為300 IJs/mL 的線蟲懸浮液滴加各牙簽盒（牙簽盒的處理同1.2.3）中，各牙簽盒里滅菌土的水分含量分別用無菌水調(diào)節(jié)為3%、6%、9%、18%和36%，每處理重復(fù)3次，各處理置于同一恒溫箱中，溫度為25℃、相對濕度為80%。分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查記錄蠐螬死亡情況并計算死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0 和Excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，昆蟲病原線蟲對蠐螬的致病力用蠐螬校正死亡率或死亡率表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲的分離、鑒定與篩選

2.1.1 昆蟲病原線蟲的分離

利用大蠟螟末齡幼蟲對2批次土樣進(jìn)行昆蟲病原線蟲活體誘集，成功誘集到了2 種昆蟲病原線蟲的幼蟲，編號分別ES7-1 和ES10-1。

2.1.2 昆蟲病原線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

ES7-1 和ES10-1 的各項形態(tài)學(xué)觀測數(shù)據(jù)如表1 所示。與Hominick 等［16］報道的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，ES7-1和ES10-1 的主要形態(tài)特征分別與斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲最為接近。因此，本研究將ES7-1和ES10-1分別初步鑒定為斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲。

表1 2 種待鑒定昆蟲病原線蟲的成蟲與4 種昆蟲病原線蟲的形態(tài)比較Table 1 Comparison of morphology between adults of 2 species of Entomopathogenic nematodes and 4 species of Entomopathogenic nematodes

2.1.3 致病性昆蟲病原線蟲的篩選

2 種昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致病力結(jié)果如表1。供試的2 種昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致病力在處理后24～48 h 時差異較小，金龜子的校正死亡率均低于10%。隨著線蟲侵染時間延長，2 種昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致死率均呈遞增趨勢。在感染斯氏線蟲96 h 和120 h后，銅綠麗金龜1齡幼蟲的其校正死亡率分別為61.67%和86.67%，顯著高于感染嗜菌異小桿線蟲后的校正死亡率（46.67%和61.67%）。

2 種昆蟲病原線蟲對暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致病力結(jié)果如表2。供試的2 種昆蟲病原線蟲對暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致病力在處理后24～48 h 時差異較小，金龜子的校正死亡率均低于10%。隨著線蟲侵染時間延長，2 種昆蟲病原線蟲對暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致死率均呈遞增趨勢。在感染斯氏線蟲96 h 和120 h后，暗黑鰓金龜1齡幼蟲的校正死亡率分別為55.00%和78.33%，顯著高于感染嗜菌異小桿線蟲的校正死亡率（45.00%和56.67%）。

表2 2 種昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜1 齡幼蟲致病力Table 2 Pathogenicity of two species of Entomopathogenic nematodes to the 1st instar larvae of A.corpulenta

表3 2 種昆蟲病原線蟲對暗黑鰓金龜1 齡幼蟲致病力Table 3 Pathogenicity of two species of Entomopathogenic nematodes to the 1st instar larvae of H.parallela

通過篩選試驗得出，斯氏線蟲對2種金龜子的致病力高于嗜菌異小桿線蟲的致病力。同時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致病力要明顯高于對暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致病力。

2.2 影響斯氏線蟲對銅綠麗金龜致病力的因素

2.2.1 不同侵染劑量對斯氏線蟲對銅綠麗金龜致病力的影響

同一溫度和土壤濕度條件下，不同侵染劑量的斯氏線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×Y(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出，斯氏線蟲侵染銅綠麗金龜幼蟲24 h時，僅當(dāng)線蟲劑量為300 IJs/mL時，金龜子幼蟲出現(xiàn)死亡，死亡率為10%；隨著侵染時間延長，各劑量濃度的斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致死率均增加；相同侵染時長下，線蟲劑量為300 IJs/mL 的致死率均要高于其它劑量處理組，在120 h時達(dá)最高值，為98.33%；當(dāng)侵染時間在48～96 h之間時，100 IJs/mL、200 IJs/mL、400 IJs/mL 和500 IJs/mL 劑量處理對綠麗金龜幼蟲的致死率差異較?。黄浯螢?00 IJs/mL劑量，500 IJs/mL劑量線蟲對綠麗金龜幼蟲的致病力最弱，死亡率僅為45.00%。

圖1 不同侵染劑量的斯氏線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×ig.1 Pathogenicity of different infection doses of S.carpocapsae to A.corpulenta

2.2.2 不同溫度對斯氏線蟲對銅綠麗金龜致病力的影響

相同侵染劑量，同一土壤濕度條件下，不同溫度條件下斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力結(jié)果如圖2 所示。隨著侵染時間延長，不同溫度條件下，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致死率均增加；在25 ℃條件下，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力最強，當(dāng)侵染120 h后，銅綠麗金龜幼蟲的死亡率為96.67%；在10 ℃條件下，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力最弱，當(dāng)侵染120 h 后，銅綠麗金龜幼蟲的死亡率僅為28.33%；同一侵染時間內(nèi)，20 ℃和30 ℃、15 ℃和35 ℃條件下，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力差異較小。

圖2 不同溫度下斯氏線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×ig.2 Pathogenicity of S.carpocapsae to A.corpulenta at different temperatures

2.2.3 不同土壤濕度對斯氏線蟲對銅綠麗金龜致病力的影響

相同侵染劑量和同一溫度條件下，不同土壤濕度條件下斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果表明：隨著侵染時間延長，不同土壤濕度條件下，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致死率均增加；當(dāng)土壤濕度為18%時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力較其他濃度條件強，當(dāng)侵染120 h后，金龜子死亡率為93.33%；當(dāng)侵染48～72 h 后，土壤濕度為3%、6%和9%時，線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力差異較??；當(dāng)侵染120 h后，土壤濕度為3%時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力最弱，金龜子幼蟲死亡率為51.67%，當(dāng)土壤濕度為9%和36%時，線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力差異較小。

圖3 不同土壤濕度下斯氏線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×ig.3 Pathogenicity of S.carpocapsae to A.corpulenta at different soil humidity

3 討論

蠐螬是金龜子類幼蟲總稱，一般以植株地下塊莖和嫩根為食，導(dǎo)致農(nóng)作物水分?jǐn)嗔?、營養(yǎng)運輸受阻，使植株生長不良，甚至死亡。蠐螬發(fā)生與地勢、氣象條件、土壤條件、種群數(shù)量及為害時期關(guān)系密切［17,18］。蠐螬防治方法包括化學(xué)防治、物理防治及生物防治。化學(xué)防治操作方便且見效快，但具有高毒性、高殘留特點，不僅對環(huán)境造成污染，還會影響人類健康。物理防治是利用金龜子趨光性，通過白熾燈或紫外燈達(dá)到誘殺目的，是防治蠐螬成蟲的有效方法。生物防治主要是利用昆蟲病原微生物、昆蟲病原線蟲感染蠐螬，誘發(fā)蠐螬幼蟲死亡而發(fā)揮防治作用［19-23］。昆蟲病原線蟲具有可大量生產(chǎn)、防治效果好等優(yōu)勢，是未來我國生物防治蠐螬的重要發(fā)展方向。

不同種類的線蟲對蠐螬的致病力不同，本文通過篩選得出，斯氏線蟲對本地蠐螬的致病力強于嗜菌異小桿線蟲的致病力，可能與昆蟲病原線蟲的活動力強弱有密切關(guān)系［24］。室內(nèi)測試結(jié)果表明，當(dāng)侵染劑量為300 IJs/mL 時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力最強，說明昆蟲病原線蟲能否有效控制害蟲與其在土壤中存活的基數(shù)相關(guān)，基數(shù)過大或者過小，均會影響其整體致病力。其次，隨著侵染時間延長，病原線蟲對金龜子的致病力均加強，但當(dāng)侵染時間為48～96 h 之間時，線蟲劑量為300 IJs/mL 的致死率顯著高于其他組，可能因病原線蟲的致病力具有時效性，具體原因還需進(jìn)一步研究分析。

環(huán)境溫度和濕度會直接影響昆蟲病原線蟲對寄主的致病能力［25］。本文研究得出，環(huán)境溫度為25 ℃時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力最強，在侵染120 h 后，金龜子幼蟲的死亡率為96.67%。當(dāng)土壤濕度為18%時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力最強，在侵染120 h 后，金龜子死亡率為93.33%。謝欽銘等［26］研究表明，大多數(shù)昆蟲病原線蟲在5～10 ℃基本停止活動，25 ℃移動最為活躍，35 ℃以上時，線蟲沒有致病力。土壤濕度過低或過高不僅影響到線蟲的活動，還有可能致使線蟲缺氧或脫水死亡，較為適宜的土壤濕度在提高線蟲擴散能力的同時增強了其對寄主的侵染能力，叢斌［27］等研究表明適宜線蟲的土壤含水量為20%左右，在10%～30%范圍內(nèi)均不影響線蟲繼續(xù)侵染寄主，但長時間浸水和干燥會使線蟲死亡。

蠐螬在恩施地區(qū)主要危害種類為銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜，其中銅綠麗金龜為一年一代危害，暗黑鰓金龜為兩年一代危害，考慮到金龜?shù)挠鸹瘯r間為3 個月，不同金龜?shù)纳L、生活周期也有區(qū)別。由于本文研究得出斯氏線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×娪趯Π岛邛w金龜?shù)闹虏×?，因此在田間利用斯氏線蟲防治需要確定蠐螬的最佳防治窗口，還需要結(jié)合不同金龜子成蟲的蟲口密度、田間的地溫和幼蟲蟲口密度等，此方面還需進(jìn)一步調(diào)查研究。

4 結(jié)論

本文從恩施地區(qū)利川市林業(yè)局甘溪山銀杏GAP基地分離得到斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲2 種昆蟲病原線蟲，以恩施地區(qū)主要危害蠐螬種類（銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜）為防治對象，經(jīng)過篩選得出斯氏線蟲對本地蠐螬的致病力強于嗜菌異小桿線蟲，斯氏線蟲對銅綠麗金龜?shù)闹虏×娪趯Π岛邛w金龜?shù)闹虏×?。?jīng)室內(nèi)測定得出，當(dāng)侵染劑量為300 IJs/mL時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力最強；25 ℃條件下，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力最強；當(dāng)土壤濕度為18%時，斯氏線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力最強。該研究結(jié)果為后續(xù)利用斯氏線蟲生防制劑防治當(dāng)?shù)劂y杏蠐螬提供了理論參考依據(jù)。