李明,王磊,范婷婷,石佳奇,高尚,季韜,萬金忠,龍濤*,袁旭音
(1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所,南京210042;2.國家環(huán)境保護土壤環(huán)境管理與污染控制重點實驗室,南京210042;3.河海大學環(huán)境學院,南京210098)
隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)如采礦、冶煉等活動的不斷開展以及農(nóng)藥、化肥的過量施用,越來越多的重金屬化合物被帶入到土壤環(huán)境中,造成土壤重金屬污染問題[1]。2014年公布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示,我國土壤重金屬鎘(Cd)的調(diào)查點位超標率達到7%,其中重度Cd污染點位比例為0.5%。Cd已經(jīng)成為我國土壤尤其是耕地土壤中主要的無機污染物之一[2]。進入到土壤中的Cd能夠與土壤膠體、有機質(zhì)和礦物質(zhì)等結(jié)合,還能以離子態(tài)形式(如Cd2+、CdOH+、CdCl+等)存在于土壤孔隙水環(huán)境中[3]。這部分離子態(tài)Cd較易與生物受體結(jié)合,進而在生物體內(nèi)積累和分布,產(chǎn)生毒性響應。研究表明,與土壤中總Cd含量相比,通過原位土壤溶液采集器采集到的土壤孔隙水中Cd含量能夠更好地預測植物體內(nèi)Cd積累量及其遷移能力[4]。土壤孔隙水中的Cd含量及其形態(tài)被認為是土壤Cd生物有效性的主要來源之一。生物炭因具有較高的比表面積、豐富的表面含氧官能團和高的pH值等理化特性,能夠通過表面沉淀、吸附、離子交換和靜電結(jié)合等作用結(jié)合重金屬離子,降低其生物有效性[5-6]。蔣田雨等[7]和佟雪嬌等[8]的研究指出,施加2%~5%的農(nóng)作物秸稈生物炭(300、400℃)能顯著提高不同性質(zhì)紅壤上Cu2+和Cd2+的吸附量;生物炭對土壤上重金屬離子吸附量的促進作用不僅與生物炭類型有關,還取決于土壤主要理化性質(zhì)如pH、陽離子交換量(CEC)和膠體表面電荷等。近年來,生物炭及其改性材料已經(jīng)被廣泛地應用于吸附去除土壤或水體環(huán)境中的重金屬污染物,具有原材料來源廣泛、成本低及環(huán)境友好等優(yōu)勢[9-12]。然而,與生物炭相關的研究較多關注其在環(huán)境中的吸附效應,需要更多地關注生物炭施加下重金屬生物有效性的改變及其對產(chǎn)生的植物毒性效應的預測能力,進而為合理評價生物炭材料的安全適用性提供參考[13]?;诖耍狙芯繑M開展模擬土壤溶液中生菜幼苗生長實驗,分析玉米秸稈生物炭施加對溶液中Cd2+吸附行為的影響,探討玉米秸稈生物炭施加對Cd生物有效性的影響及其與生菜生長及根中Cd積累量之間的預測關系。
供試生物炭的前體物料為玉米秸稈,將其經(jīng)自來水和去離子水沖洗干凈后放入烘箱中105℃烘干6 h,烘干后的秸稈在粉碎機中進行破碎后過60目(0.25 mm)篩保存[14]。烘干的玉米秸稈在ZBX1型炭化爐(中國科學院南京土壤研究所)進行厭氧燒制,具體操作過程參考已有研究[14-15]。玉米秸稈生物炭的制備條件為400℃下保持8 h后獲得,冷卻后的生物炭材料經(jīng)研磨后過0.25 mm篩保存,以備炭材料性質(zhì)表征及培養(yǎng)實驗使用。玉米秸稈生物炭的主要性質(zhì)為:pH 8.71±0.54(炭∶水=1∶20,Orion Star A211pH meter測定);生物炭中C、H、O元素的質(zhì)量分數(shù)分別為80.8%、1.05%和11.9%(Vario MICRO型元素分析儀);其Cd含量低于ICP-OES的最低檢測限。
由于真實土壤組分多變,這為在可控實驗條件下探討不同pH值如何影響重金屬產(chǎn)生植物毒性的研究增加了難度。參考Wang等[16]的研究,論文中采用模擬土壤溶液開展植物溶液培養(yǎng)實驗。模擬土壤溶液的主要組成為0.20 mmol·L-1CaCl2、0.20 mmol·L-1MgCl2、1.0 mmol·L-1KCl和1.0 mmol·L-1NaCl。實驗設置兩個pH條件(4.3和7.0),分別使用適量的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至目標值,并加入4 mmol·L-1MES[2-(N-嗎啡啉)乙磺酸]作為緩沖溶液控制實驗條件下的pH值。Lock等[17]的研究表明,MES不會對溶液中金屬離子的化學形態(tài)產(chǎn)生顯著影響,且不具有生物體毒性。實驗設置6個濃度的CdCl2處理水平,分別為0、0.5、1、2、5μmol·L-1和15μmol·L-1CdCl2;2個生物炭處理水平,分別為0%和2%(m/V)。因此,實驗過程中的處理組為:2個生物質(zhì)炭水平×2個pH水平×6個CdCl2水平=24組。
生菜(Lactuca sativavar.longifolia)是一種常見的葉類蔬菜,適合于土壤和水培種植,其根系發(fā)達,較易于富集重金屬污染物如Cd[18]。因此,本研究選擇生菜開展模擬土壤溶液的植物培養(yǎng)實驗。生菜種子購自河北省青縣王鎮(zhèn)種子繁育站。選擇健康飽滿的生菜種子在0.5%的NaClO溶液中浸泡10 min消毒,然后用去離子水沖洗種子表面至少6次以上,去除殘留的NaClO。用去離子水潤濕濾紙并將其平鋪于洗凈的玻璃培養(yǎng)皿上,將生菜種子均勻地播散在濾紙上,放置于20℃、濕度為75%的光照培養(yǎng)箱中,黑暗條件下發(fā)芽48 h。生菜發(fā)芽實驗參照Wang等[16]和美國環(huán)境保護署(EPA)的要求開展。發(fā)芽結(jié)束后,選擇具有一致初始根長(1~2 cm)的生菜幼苗用于后續(xù)生菜培養(yǎng)實驗。
將上述生菜幼苗仔細轉(zhuǎn)入到裝有500 mL處理組溶液的聚丙乙烯燒杯中,每個燒杯中移植6株生菜幼苗,開展生菜培養(yǎng)實驗。實驗用儀器均在實驗前經(jīng)酸浸泡至少24 h后清洗晾干。各處理組設置3個重復,均放置于20℃、濕度為75%的光照培養(yǎng)箱中光照10 h,黑暗14 h條件下培養(yǎng)3 d。實驗結(jié)束后,小心取出各處理組的生菜幼苗置于2 mmol·L-1的EDTA溶液中浸泡10 min,再用去離子水沖洗干凈后放置于干燥的濾紙上吸干植株表面水分。用直尺測量每株幼苗的根長(cm),并在天平上稱量幼苗鮮質(zhì)量(mg)。上述指標測量完成后將生菜幼苗根切下,置于烘箱中105℃烘干4 h后冷卻至恒質(zhì)量,稱量烘干后的根干質(zhì)量(mg)并記錄。將烘干后的根粉碎后放入到25 mL的三角燒瓶中,向其中加入20 mL 5 mol·L-1的HNO3(優(yōu)級純)溶液,輕輕晃動后靜置過夜。將上述三角燒瓶置于電熱板上消煮(70~150℃),待消煮液基本澄清后煮干酸液,再向其中加入5 mL 2 mol·L-1HCl后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容。樣品消煮過程中采用國家標準物質(zhì)菠菜(GBW 10015)進行質(zhì)量控制。所有樣品中Cd含量均通過ICP-MS測定(iCAP Qc,ThermoFisher,USA),GBW 10015的回收率為97.7%±3.5%。
參考相關文獻[7,15],本研究配制Cd2+濃度為0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol·L-1的CdCl2溶液,以模擬土壤溶液(0.20 mmol·L-1CaCl2、0.20 mmol·L-1MgCl2、1.0 mmol·L-1KCl和1.0 mmol·L-1NaCl)作為吸附實驗的背景溶液。稱取質(zhì)量為0.500 g的混合了玉米秸稈生物炭的土壤樣品(見1.1)于50 mL塑料離心管中,分別加入25 mL上述濃度的Cd2+溶液,濃度為Ci,用HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)溶液pH值為4.3和7.0,加入4 mmol·L-1的MES(醇醚磺基琥珀酸單酯二鈉鹽)以控制溶液pH值。每個處理組重復3次。封蓋,25℃恒溫振蕩(250 r·min-1)24 h后以4 500 r·min-1離心10 min,離心上清液過0.45μm濾膜后得到吸附平衡液,濃度為Ce。不同pH處理下Cd2+的吸附量(qe,mmol·kg-1)可通過下式計算:
式中:Ci和Ce分別為Cd2+在初始溶液和吸附平衡溶液中的濃度,mmol·L-1;v為平衡溶液的體積,mL;m為生物炭質(zhì)量,g。
為探究Cd在生物炭上的吸附特性,論文中采用Langmuir和Freundlich公式對吸附等溫線對數(shù)據(jù)進行擬合。公式分別為:式中:qe和qm分別為生物炭上Cd2+的平衡吸附量和最大吸附量,mmol·kg-1;Ce為Cd2+在吸附平衡溶液中的濃度,mmol·L-1;KL、Kf、n均為吸附常數(shù)。
為探討不同pH和Cd2+吸附對生物炭表面電荷特性的影響,對生物炭的表面Zeta電位值進行了測定。稱取4.000 g過0.054 mm篩的玉米秸稈生物炭于250 mL三角瓶中,分別加入0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol·L-1的CdCl2溶液200 mL,以1 mmol·L-1的NaCl作為支持電解質(zhì)。每個處理組設置4個平行。使用稀NaOH和HCl調(diào)節(jié)溶液pH值為4.3和7.0,25℃下振蕩24 h后重新調(diào)節(jié)溶液pH值至4.3和7.0。將上述溶液室溫下放置48 h后通過JS94H微電泳儀測定溶液的電泳淌度,并經(jīng)由軟件計算得到Zeta電位值。
生菜幼苗的相對根伸長抑制率RRE可用于評價根的毒性響應,其計算公式為:
式中:RLT、RLC分別為各處理組培養(yǎng)3 d后Cd2+脅迫下的根長和對照組中不含Cd2+下的根長,cm;RL0為生菜幼苗在Cd2+完全脅迫下的根長,即幼苗移植時的根長,cm。
通過Weibull公式能夠擬合生菜幼苗暴露于各處理組時的相對根伸長抑制率指標,其公式為:
式中:{Cd2+}為模擬土壤溶液中Cd的生物有效性,分別以總Cd含量(Cdtota)l和離子態(tài)Cd含量(Cd2+)表示;系數(shù)c和d均可通過回歸分析得到。
在毒理學研究中,毒性污染物對生物體生長指標產(chǎn)生50%抑制效應時候的濃度被定義為是該毒性污染物的EC50。在本研究中,當RRE=50%時所需要的Cd的EC50值計算如下:
生菜根中Cd的積累量(Cduptake)可基于米氏方程(Michaelis-Menten equation)進行擬合,其公式為:
式中:k為{Cd2+}與生物體上結(jié)合位點之間的結(jié)合、內(nèi)化速率常數(shù);Km為米氏常數(shù);{Cd2+}為模擬土壤溶液中Cd的生物有效性,分別以總Cd含量(Cdtotal)和離子態(tài)Cd含量(Cd2+)表示。
實驗中Cd2+含量基于模擬土壤溶液組成,通過Visual minteq 3.1軟件計算得到;實驗數(shù)據(jù)主要通過Sigmaplot 10.0進行數(shù)據(jù)擬合和作圖。
不同pH值對Cd2+在玉米秸稈生物炭上吸附量的影響如圖1a所示。結(jié)果表明,Cd2+在生物炭上的吸附量會隨溶液pH值和Cd2+平衡濃度的增加而增大。Langmuir和Freundlich公式均能較好地擬合Cd2+在生物炭上的吸附行為(r2>0.80),擬合參數(shù)結(jié)果見表1。Langmuir公式擬合結(jié)果顯示在pH 7.0時,生物炭對Cd2+的最大吸附量Qm為87.3 mg·g-1,這高于pH 4.3時的25.4 mg·g-1;Freundlich公式擬合也得到了類似的結(jié)果,pH 7.0時較高的Kf值表明其中Cd2+的吸附強度要高于pH 4.3的處理組。與Freundlich公式相比,Langmuir公式能夠更好地擬合Cd2+在生物炭上的吸附行為(表1)。Zeta電位值反映的是溶液中的膠體顆粒在外加電場作用時膠體與溶液相滑動面上的電位值,它主要受到膠體表面電荷特性和環(huán)境條件等的影響。如圖1b所示,玉米秸稈生物炭表面帶負電荷,其在pH 4.3時的表面電負性(-21.9±0.09 mV)小于pH 7.0(-23.8±0.67 mV)。隨著溶液中Cd2+濃度的增大,生物炭表面電負性不斷降低。對比圖1a和圖1b可以發(fā)現(xiàn),生物炭的Zeta電位值變化趨勢與Cd2+在生物炭上的吸附行為密切相關,即具有較低Zeta電位值的生物炭處理組中Cd2+吸附量更高。
表1 Cd2+在生物炭上的等溫吸附過程的Langmuir與Freundlich方程擬合Table 1 Isothermal adsorption of Cd2+on biochar based on Langmuir and Freundlich equations
事實上,經(jīng)厭氧熱解過程制得的生物炭材料一般具有較強的堿性,這主要體現(xiàn)為其表面的無機物和有機物組分兩部分[5]。一方面,生物質(zhì)中的含碳組分在高溫裂解條件下灰化,形成碳酸鹽類物質(zhì),從而提高生物炭表面的堿性;另一方面,生物炭表面豐富的—COO—和—OH等含氧官能團以陰離子形式存在,能夠與溶液中的H+結(jié)合,進而影響溶液的酸堿度。因此,本研究主要考慮pH值對Cd2+在生物炭上吸附行為的影響。此外,生物炭表面豐富的含氧官能團和鹽基離子(Na、K、Ca和Mg等)還是生物炭陽離子交換量(CEC)的重要來源,這決定了生物炭表面負電荷的數(shù)量[6]。隨著溶液pH值的升高,生物炭表面含氧官能團的解離程度增大,導致其表面有機陰離子數(shù)量增加,從而具有更低的Zeta電位值。蔣田雨等[7]的研究表明,稻草生物炭能夠顯著提高土壤膠體的電負性,進而通過靜電吸附效應增加Cd2+在土壤上的吸附量。因此,溶液中的Cd2+能夠通過非專性的靜電吸附作用與生物炭相結(jié)合,且易于受到溶液pH值的影響。此外,李力等[11]的研究指出,生物炭上的π共軛芳香結(jié)構(gòu)能夠與Cd2+發(fā)生配位作用,從而增加Cd2+在生物炭上的吸附量,但該作用受溶液pH值的影響較小。
不同pH條件下,施加生物炭對生菜幼苗根長和干質(zhì)量的影響如圖2所示。生菜根長和干質(zhì)量值均隨溶液中Cd含量的增大而降低;2%玉米秸稈生物炭的施加能夠促進生菜幼苗生長并緩解Cd對生長的抑制效應。與無生物炭處理的對照組相比,2%生物炭施加將幼苗根長值分別提高了21.2%(pH 7.0)和6.84%(pH 4.3)。當溶液中Cd總量(Cdtotal)為5.3 μmol·L-1時,2%生物炭施加下的幼苗根長分別提高了39.6%(pH 7.0)和70.7%(pH 4.3)。類似地,與無生物炭處理的對照相比,生物炭的施加顯著提高了生菜干質(zhì)量,分別達到24.8%(pH 7.0)和42.1%(pH 4.3)。生物炭材料通常含有豐富的礦質(zhì)元素如Ca、Mg、Na和K等,使其不僅能通過離子交換等作用更多地結(jié)合溶液中的Cd2+,還能為植物生長提供必需的礦質(zhì)養(yǎng)分[13]。因此,施加生物炭能夠緩解Cd產(chǎn)生的生菜生長脅迫效應并促進其生物量的增加。
通過Weibull公式分別擬合了溶液中Cdtotal含量,溶液中的Cd2+含量與生菜相對根伸長抑制率RRE之間的相關性(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),溶液中的Cd2+含量能夠解釋80%的RRE變異性(r2=0.80,P<0.001),這高于Cdtotal(r2=0.71,P<0.001)。相較于重金屬總量指標,土壤中離子態(tài)重金屬含量被認為更能夠表征重金屬產(chǎn)生的植物毒性和積累效應。早在1983年,Morel[19]就提出了水環(huán)境中金屬離子活度值是其生物有效性和毒性的主要來源的觀點,即自由離子活度模型(FIAM)。在后續(xù)的研究中又陸續(xù)發(fā)現(xiàn),環(huán)境因素如pH、有機質(zhì)含量和共存陽離子等會對重金屬離子的毒性效應產(chǎn)生影響(增強或緩解)[20]。基于Weibull公式的擬合參數(shù),計算得到不同pH和生物炭施加水平下,生菜幼苗根生長達到50%抑制時的Cd2+效應濃度值即EC50值(表2)。在不施加生物炭時,較低的pH值(4.3)具有較高的根毒性效應,其EC50值(5.78μmol·L-1)低于pH 7.0時的EC50值(9.38μmol·L-1)。2%的生物炭施加顯著提高了兩組pH值條件下的EC50值,pH 4.3時的EC50提高了4.43倍,pH 7.0時的EC50值提高了2.42倍。余淑娟等[21]通過8種不同pH值土壤上的番茄盆栽實驗發(fā)現(xiàn),土壤pH值是影響番茄根伸長響應外源Cd脅迫的重要因素,根生長達到20%抑制率時的Cd濃度值(EC20)會隨土壤pH值的增大而增大。事實上,在不同pH值和生物炭添加水平下,溶液中Cd2+含量的降低是處理組中EC50值升高的重要原因,生菜幼苗根長和干質(zhì)量也會隨之增加。
盡管本研究得到了與前人[22-23]類似的結(jié)果,即溶液中金屬離子濃度能夠更好地預測其產(chǎn)生的植物根毒性效應如根長、體內(nèi)金屬積累量等,但仍需注意到,本研究中Cd2+與生菜幼苗根伸長抑制率之間的回歸相關性僅略高于模擬土壤溶液中Cdtotal的預測能力。這可能與生物炭施加使得一部分Cd2+被吸附在其表面,從而減少了模擬土壤溶液中Cd2+含量有關,而基于Visual minteq軟件計算得到的Cd2+活度值并不能完全反映溶液中Cd2+的真實含量。因此,在施用改良劑如生物炭的重金屬污染土壤中,需要考慮改良劑對實際土壤孔隙水中重金屬離子含量的影響,以綜合全面評價改良劑的環(huán)境風險及其適用性。
表2基于Weibull公式計算得到50%根伸長抑制率時Cd2+的效應濃度值(EC50)Table 2 Effective concentrations of Cd2+(EC50)at 50%inhibition of root elongation based on Weibull equation
2%生物炭施加對生菜根中Cd積累量的影響如圖4所示。生菜根中Cd的積累量會隨著溶液中Cdtotal含量的增加而增加,但會隨溶液pH值的增加而降低;2%玉米秸稈生物炭的施加則減少了根中Cd的積累量。如當溶液中Cdtotal含量為14.8μmol·L-1時,玉米秸稈生物炭的施加對根中Cd積累量的降低百分數(shù)分別為20.3%(pH 7.0)和17.3%(pH 4.3)。然而,生物炭降低根中Cd積累量的能力會隨溶液中Cdtotal含量的增加而減小。當溶液中Cdtotal為0.40μmol·L-1時,施加2%生物炭對根中Cd積累量的降低程度最高,分別達到65.1%(pH 7.0)和63.1%(pH 4.3)?;诿资戏匠痰臄M合結(jié)果顯示(圖4),模擬土壤溶液中Cd2+對根中Cd積累量的預測能力(r2=0.88,P<0.001)略高于Cdtotal(r2=0.79,P<0.001)。有研究指出[24],植物體內(nèi)金屬積累量與其毒性響應(如根伸長、酶活性等)之間具有較好的回歸相關性,但在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。線性回歸分析結(jié)果顯示(圖5),生菜幼苗根中Cd的積累量能夠預測68%的生菜根長變異性數(shù)據(jù)(r2=0.68,P<0.001),而對幼苗干質(zhì)量的預測能力只有53%(r2=0.53,P<0.001)。由此可見,進入到植物體內(nèi)積累的重金屬總量指標并不總能很好地表征其產(chǎn)生的毒性效應。Wallace等[25]指出,生物體內(nèi)的重金屬能夠與不同的生物體組分結(jié)合?;谏矬w亞細胞分室模型,可以將生物體內(nèi)的重金屬區(qū)分為生物解毒組分(微粒體和熱穩(wěn)定蛋白組分相結(jié)合的重金屬)和生物毒性敏感組分(細胞器和熱應激蛋白組分相結(jié)合的重金屬)[26]。其中,生物毒性敏感組分的重金屬是導致生物體毒性響應的主要因素。因此,相較于模擬土壤溶液中Cd2+含量(r2>0.75),生菜幼苗根中Cd的積累量(r2<0.70)并不能更好地反映Cd的生物有效性。此外,施加生物炭不僅能夠降低Cd的生物有效性,還能夠影響其他礦質(zhì)養(yǎng)分如Ca、Si等的生物有效性,進而通過根表競爭結(jié)合位點和共享離子通道等形式影響Cd在植物體內(nèi)的積累和分布[27-28]。
(1)Cd2+在玉米秸稈生物炭上的吸附行為符合Langmuir公式;玉米秸稈生物炭能夠通過靜電吸附效應結(jié)合溶液中的Cd2+,該過程會受到溶液pH值的影響。
(2)玉米秸稈生物炭施加能顯著緩解重金屬Cd對生菜幼苗根生長的脅迫效應,這與溶液中Cd2+含量降低有關;相較于溶液中Cdtotal含量和根中Cd積累量指標,溶液中Cd2+含量能夠更好地評價幼苗根毒性效應,是玉米秸稈生物炭施加下Cd生物有效性的主要來源。