鄭研，李嵐，高秋英，牛奔，張維華

陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，西安 710068

miR-17-92基因簇位于人13q31.3染色體，具有高度保守性，編碼miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92六個(gè)成熟的miRNA[1]，被認(rèn)為是原癌基因miRNA的代表，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。miR-17-92基因簇與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)，有望成為潛在的腫瘤標(biāo)志物或治療新靶點(diǎn)[3]。腫瘤細(xì)胞中miRNA可通過Notch、Wnt/β-catenin、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等多種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[4]。TGF-β是一組負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖的多效性細(xì)胞因子[5]，其中TGF-β1是TGF-β家族中一種多功能生長(zhǎng)調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1參與多種腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用，與細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)與發(fā)育等密切相關(guān)[6-7]。miR-17-92在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞中扮演何種角色以及與TGF-β1信號(hào)通路的關(guān)系仍不明確。本研究旨在探討miR-17-92在CML細(xì)胞增殖和凋亡中的調(diào)控角色以及與TGF-β1信號(hào)通路的關(guān)系，這對(duì)了解CML發(fā)生機(jī)制及臨床攻克CML具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料 16例CML骨髓標(biāo)本和13例健康者骨髓標(biāo)本來自陜西省人民醫(yī)院。CD34+細(xì)胞磁柱分選試劑盒(Easy Sep human CD34 Selection Kit，德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：130-046-702)分選CML骨髓標(biāo)本和健康者骨髓標(biāo)本中的CD34+細(xì)胞，將分離的細(xì)胞按1×106/mL的密度接種至24孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。CML細(xì)胞系K562由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所提供，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-17-92簇表達(dá) 采用Trizol 試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)根據(jù)其說明書提取K562細(xì)胞和健康者造血干細(xì)胞的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量。使用TaqMan? Micro RNA Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)，AB Applied Biosysytems)分別反轉(zhuǎn)錄u6、17、18a、19a、20a、19b、92 cDNA。利用 u6、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92探針引物進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，在7500 Fast Real-Time PCR儀(Agilent Technologies)上進(jìn)行操作，20 μL反應(yīng)體系：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，miRNA正向引物0.8 μL，反向引物0.8 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1∶3稀釋)2 μL，無酶水 6 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 34 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后記錄各反應(yīng)管Ct值，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法定量分析miR-17-92基因簇的相對(duì)表達(dá)量。miR-17-92基因簇引物序列如表1所示。

表1 hsa-miR-17-92引物序列

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 K562細(xì)胞按2×105/孔鋪于24孔板上。miRNA mimic(control、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92)購(gòu)于上海生工生物科技公司，無血清RPMI 1640培養(yǎng)基25 μL與上述質(zhì)?；旌?，室溫靜置5 min。將稀釋的轉(zhuǎn)染試劑和 miRNA mimic混合，室溫靜置10 min。混合物加入至K562細(xì)胞中，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) miRNA mimic轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，7 ℃孵育3 h后使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD450)，以450 nm處的吸光度表示細(xì)胞的增殖能力。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) miRNA mimic轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞48 h后，收集各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，用100 μL binding buffer重懸細(xì)胞。取2×105個(gè)細(xì)胞鋪于24孔板，培養(yǎng)48 h后，分別加入Annexin V-APC和Propidium Iodide(PI)5 μL，室溫下避光15 min后，染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western-blot檢測(cè)TGF-β1蛋白的表達(dá) miRNA mimic轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞48 h后，收集各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，利用4 ℃預(yù)冷的蛋白裂解液置于冰上裂解細(xì)胞；采用HeraeusMultifuge×1R離心機(jī)(美國(guó)，ThermoScientific，離心機(jī)半徑40 cm)，4 ℃、1 200 r/min離心20 min，取上清液，即為提取的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST稀釋抗體，1∶1 000加一抗，4 ℃過夜，TBST洗3遍，TBST稀釋抗體，1∶5 000加二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3遍。ECL發(fā)光劑加于膜上，發(fā)光儀曝光，采集圖像，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，分析檢測(cè)TGF-β1蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CML及健康者CD34+細(xì)胞中miR-17-92簇表達(dá)水平 結(jié)果顯示，CML的CD34+細(xì)胞中miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-92表達(dá)水平均高于健康者CD34+細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均< 0.05)，兩組CD34+細(xì)胞中miR-20a和miR-92表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.001)，而兩組miR-19b表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見圖1。

注：與健康者CD34+細(xì)胞比較，aP< 0.05,bP< 0.01,cP< 0.001圖1 健康者CD34+細(xì)胞及CMLCD34+細(xì)胞中miR-17-92表達(dá)水平

2.2 miR-17-92抑制K562細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92后K562細(xì)胞凋亡率較健康對(duì)照組均顯著降低(P< 0.05)。見圖2。

2.3 miR-17-92促進(jìn)K562細(xì)胞增殖 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h、72 h后，轉(zhuǎn)染miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92 的K562細(xì)胞增殖能力較健康對(duì)照組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見圖3。

2.4 Western-blot檢測(cè) 利用Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-17-92后K562細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92后K562細(xì)胞中TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量較健康對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均< 0.01)。見圖4。

注：與模擬對(duì)照比較，aP< 0.05，bP< 0.01圖2 轉(zhuǎn)染miR-17-92 mimic對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

注：與模擬對(duì)照比較，aP< 0.05圖3 轉(zhuǎn)染miR-17-92 mimic對(duì)K562細(xì)胞增殖能力的影響(n=3)

注：與模擬對(duì)照比較，aP< 0.01圖4 轉(zhuǎn)染miR-17-92 mimic對(duì)K562細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)水平的影響(n=3)

3 討論

CML是臨床常見的造血干細(xì)胞增生性疾病，其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)乃至世界仍居高不下。miRNA通過參與原癌基因及抑癌基因等多種基因表達(dá)調(diào)控，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及分化等生理進(jìn)程[8]。miRNA既可作為癌基因或抑癌基因，也可調(diào)控腫瘤信號(hào)通路上關(guān)鍵基因的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用[9]。miRNA的異常表達(dá)是造血系統(tǒng)腫瘤的特征之一。目前，miR-17-92基因簇在結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌及造血系統(tǒng)腫瘤等多數(shù)研究中均被報(bào)道異常高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因的作用[10-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92簇/QKI2/catenin組成的調(diào)控軸促進(jìn)了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。

本研究對(duì)CML CD34+細(xì)胞中miR-17-92基因簇編碼的6個(gè)成熟miRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)6個(gè)miRNA均呈現(xiàn)高表達(dá)，提示miR-17-92可能在CML發(fā)病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-17-92中每個(gè)miRNA單獨(dú)或者協(xié)同發(fā)揮致癌基因的作用，本研究結(jié)果與多數(shù)學(xué)者認(rèn)為miR-17-92基因簇發(fā)揮促癌基因的作用結(jié)果一致。本研究將miR-17-92 mimic轉(zhuǎn)染于K562細(xì)胞中，旨在明確miR-17-92在CML細(xì)胞增殖和凋亡中的調(diào)控角色。有研究報(bào)道，miR-17-92作為癌基因，其異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失控，加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。食管鱗癌中，miR-18a通過調(diào)控PTEN-PI3K-AKT-mTOR信號(hào)軸，促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。本研究對(duì)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力測(cè)定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-17、18a、19a、20a、19b、92促進(jìn)了K562細(xì)胞的增殖，且每種單一micro RNA的促增殖作用強(qiáng)度并不完全一致，提示miR-17-92簇在CML中發(fā)揮主要作用的并不是micro RNA簇內(nèi)所有基因，而是某些miRNA起主導(dǎo)作用。對(duì)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-17-92的表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡。結(jié)果與既往報(bào)道在肺癌細(xì)胞中的研究結(jié)果相一致[18]。其中每種miRNA抑制凋亡的強(qiáng)弱作用不完全相同，如轉(zhuǎn)染miR-18a抑制凋亡效果更為明顯，提示miR-17-92在CML中發(fā)揮作用并不是miR-17-92簇中所有miRNA。

明確miR-17-92表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)尋找新的CML治療靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后具有重要臨床意義。TGF-β1以無活性的形式合成并分泌，在磷酸化激酶作用下活化后與不同的受體結(jié)合，進(jìn)一步啟動(dòng)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表現(xiàn)出多樣的生物學(xué)活性，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、周期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多個(gè)生理過程[6-7]。許多細(xì)胞表面都有TGF-β受體(TGFBR)，TGF-β1的腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用與結(jié)合的受體直接相關(guān)，結(jié)合的受體不同，發(fā)揮的作用也不同。Matsuzaki等[19]認(rèn)為，腫瘤進(jìn)展期中，細(xì)胞微環(huán)境的改變導(dǎo)致TGF-β1從一個(gè)抑制信號(hào)演變成激發(fā)信號(hào)，通過促進(jìn)EMT作用誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。Zeng等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-23a簇通過調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。本研究對(duì)轉(zhuǎn)染miR-17-92后TGF-β1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)miR-17-92能使TGF-β1蛋白的表達(dá)水平升高，提示miR-17-92可能通過激活TGF-β1信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡。目前研究認(rèn)為，TGF-β1信號(hào)通路在參與腫瘤發(fā)生機(jī)制中，除了TGF-β1蛋白表達(dá)水平的改變以外，TGFBR蛋白及其下游信號(hào)分子Smads等均是TGF-β1信號(hào)通路中的關(guān)鍵點(diǎn)。因此，對(duì)于miR-17-92如何調(diào)控TGF-β1信號(hào)通路還需要進(jìn)行更加深入的研究。

綜上所述，miR-17-92在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562中異常高表達(dá)，miR-17-92表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，此過程中TGF-β1信號(hào)通路的激活可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。