閻成炟，郭崇真，張東虎，趙凌霄，林建陽(yáng)*（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110122）

糖尿病是一種以高血糖為主要臨床特點(diǎn)的常見(jiàn)的慢性內(nèi)分泌性疾病。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟的數(shù)據(jù)顯示，2015年全球糖尿病患病率為8.8%，預(yù)計(jì)2040年成人糖尿病患病率將上升到10.4%[1]。在我國(guó)成年人中，糖尿病的患病率高達(dá)11.6%[2]，而其中占比非常高的便是2型糖尿病。2型糖尿病，即非胰島素依賴型糖尿病，是糖尿病最常見(jiàn)的類型，占所有糖尿病病例的90%以上[3]?？刂撇秃笱鞘侵委?型糖尿病的關(guān)鍵。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶對(duì)碳水化合物的轉(zhuǎn)化，從而延緩葡萄糖吸收，降低餐后血糖，在全球被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的一線治療[4]。此外，除降糖活性，α-葡萄糖苷酶抑制劑還被發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移[5]、干擾宿主細(xì)胞的N-寡糖鏈生物合成以阻止病毒復(fù)制有關(guān)[6]。α-葡萄糖苷酶抑制劑具有起效快速且安全性高的特點(diǎn)。目前，在臨床上使用的上市藥物主要是阿卡波糖（acarbose）、伏格列波糖（voglibose）和米格列醇（miglitol）。傳統(tǒng)上對(duì)于α-葡萄糖苷酶抑制劑的開(kāi)發(fā)與研究大多基于其擬糖骨架結(jié)構(gòu)，例如亞胺糖、硫糖、二糖等結(jié)構(gòu)[7-8]。然而，傳統(tǒng)的研究開(kāi)發(fā)面臨著諸多問(wèn)題，比如活性差、自然豐度低和立體化學(xué)過(guò)于復(fù)雜等[9]。因此，對(duì)于非糖α-葡萄糖苷酶抑制劑的開(kāi)發(fā)具有廣闊前景[10-11]。

根據(jù)前期報(bào)道[12]，將苯磺酰胺查爾酮結(jié)構(gòu)整合到苯并吡喃中，設(shè)計(jì)得到的3-[4-（苯基磺酰胺）苯甲酰]-2H-1-苯并吡喃-2-酮結(jié)構(gòu)，具有成為非糖α-葡萄糖苷酶抑制劑的巨大潛力。在前期研究中，該系列化合物中體外活性最強(qiáng)的化合物YG-18（如圖1）的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.014±0.003）μmol·L－1，高于陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖。為了探究該藥物在體內(nèi)的降低糖負(fù)荷后的血糖藥效和作用機(jī)制、藥物與酶活性部位可能的相互作用模式與安全性，本研究考察了該系列化合物中的YG-18在正常大鼠體內(nèi)對(duì)蔗糖和葡萄糖負(fù)荷后的影響，并通過(guò)分子模擬分析研究了其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制行為。最后，根據(jù)OECD急性毒性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則[13]觀察了該藥物單次口服4 h、48 h和14 d的毒性反應(yīng)、臟器情況和存活狀態(tài)的急性經(jīng)口毒性。

圖1 YG-18的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of YG-18

1 材料

1.1 試藥

YG-18（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室，純度≥ 98.0%）；阿卡波糖（艾覽化工科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；聚氧乙烯蓖麻油EL、甘油（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；蔗糖、葡萄糖等試劑均為分析純。

1.2 儀器

One Touch Ultra Vue血糖儀[強(qiáng)生（中國(guó)）醫(yī)療器材有限公司]；SQP電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；D3024R離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）；體重秤（慈溪市天東衡器廠）；恒溫超聲儀（上?？缕顑x器設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠（22～24 g），SPF級(jí)KM小鼠（22～24 g）[遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001]。

2 方法

2.1 YG-18單次給藥對(duì)正常ICR小鼠蔗糖、葡萄糖負(fù)荷后血糖影響

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，ICR小鼠48只，隨機(jī)分為正常組、陽(yáng)性藥物阿卡波糖組（Acar，9.6 mg·kg－1，ig）和YG-18組（7.23 mg·kg－1，ig）[14]，每組8只，雌雄各半，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組平行設(shè)置兩組。其中藥物溶媒由0.67% DMSO、5% 聚氧乙烯蓖麻油EL、3% 甘油與生理鹽水組成。正常組給予空白溶媒進(jìn)行灌胃給藥。阿卡波糖組、YG-18組灌胃對(duì)應(yīng)的藥物。

禁食不禁水12 h后，平行設(shè)置的兩組小鼠分別灌胃給予蔗糖（4.0 g·kg－1）和葡萄糖（2.0 g·kg－1）負(fù)荷，用尾部采血法，通過(guò)血糖儀測(cè)定空腹血糖及給藥后0.5、1、2 h的血糖值，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。

2.2 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

利用Chemdraw 19.0繪制出阿卡波糖與YG-18的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用Chem3D 19.0將其轉(zhuǎn)變?yōu)?D結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行構(gòu)象的優(yōu)化。分子對(duì)接研究使用Discovery Studio v16.1進(jìn)行。對(duì)接計(jì)算采用從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的α-葡萄糖苷酶與葡萄糖絡(luò)合物（PDB代碼：3A4A）的晶體結(jié)構(gòu)。去除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所有的結(jié)合水，并將所有的氫原子添進(jìn)結(jié)構(gòu)中。該蛋白質(zhì)前期進(jìn)行制備、優(yōu)化和能量最小化處理。以α-葡萄糖苷酶共結(jié)晶的活性結(jié)合位點(diǎn)設(shè)置配體對(duì)接的空間，采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行對(duì)接實(shí)驗(yàn)。對(duì)接的多種結(jié)合結(jié)果中，選取了能量最低的構(gòu)象為本次實(shí)驗(yàn)對(duì)藥物與酶抑制方式的預(yù)測(cè)構(gòu)象。最后，使用Pymol和Discovery Studio v16.1繪制藥物與酶結(jié)合方式構(gòu)象。

2.3 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)OECD急性毒性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則[13]，將50只KM小鼠隨機(jī)分為4組給藥組與1組空白對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。因YG-18無(wú)毒性資料可以參考且水溶性差，故給藥組采用的是OECD急性毒性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則中推薦的175、550、1750、2000 mg·kg－1的序列給藥劑量，并使用羧甲基纖維素鈉配制混懸液灌胃給藥，除限定濃度2000 mg·kg－1外，其余對(duì)數(shù)劑量間隔1/2。

禁食不禁水12 h后，空白對(duì)照組小鼠給予溶媒羧甲基纖維素鈉單次灌胃處理，給藥組單次灌胃給藥處理，每組序貫進(jìn)行。給藥當(dāng)日連續(xù)觀察4 h，之后固定時(shí)間間隔觀察48 h。如果組內(nèi)死亡小鼠數(shù)量大于半數(shù)，則降低下一組小鼠給藥劑量；如果組內(nèi)死亡小鼠數(shù)量小于半數(shù)，則提高下一組小鼠給藥劑量。每一組存活動(dòng)物均觀察14 d，后期死亡動(dòng)物在統(tǒng)計(jì)時(shí)記為死亡。觀察結(jié)束后處死小鼠，解剖后觀察各組小鼠的器官的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等有無(wú)明顯變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，分析模型選取單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 8繪制作圖。

3 結(jié)果

3.1 YG-18單次給藥對(duì)正常ICR小鼠口服蔗糖、葡萄糖負(fù)荷后血糖水平影響

為了驗(yàn)證YG-18在體外降低餐后血糖的藥效和作用機(jī)制，選取正常ICR小鼠作為模型，單次給藥后，分別記錄蔗糖、葡萄糖負(fù)荷后的血糖水平的血糖值變化，觀察其對(duì)血糖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

YG-18在7.23 mg·kg－1的劑量下單次給藥能降低正常小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖的峰值（P＜0.05），且YG-18組的血糖濃度-時(shí)間曲線下面積顯著降低（P＜0.001）（見(jiàn)圖2A）。而在圖2B中，YG-18在7.23 mg·kg－1劑量下單次給藥對(duì)正常小鼠葡萄糖負(fù)荷后的各時(shí)間點(diǎn)的血糖和血糖濃度-時(shí)間曲線下面積均無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

圖2 YG-18（7.23 mg·kg－1）對(duì)正常ICR小鼠血糖及血糖濃度-時(shí)間曲線下面積的影響Fig 2 Effect of YG-18（7.23 mg·kg－1）on the blood glucose and the blood glucose concentration time curve in ICR rats

由此可以證明，新型化合物YG-18的體內(nèi)降糖作用的靶點(diǎn)為α-葡萄糖苷酶，只能對(duì)非單糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而發(fā)揮降糖作用，而對(duì)直接攝入葡萄糖的血糖變化無(wú)法發(fā)揮作用。

3.2 分子對(duì)接

本次實(shí)驗(yàn)分別采用了3D與2D方式展示了藥物-酶的結(jié)合構(gòu)象，見(jiàn)圖3、4。圖3展示了α-葡萄糖苷酶-阿卡波糖之間的相互結(jié)合的3D與2D構(gòu)象，圖4展示了α-葡萄糖苷酶-YG-18相互結(jié)合的3D與2D構(gòu)象。結(jié)果顯示，阿卡波糖與酶結(jié)構(gòu)中GLN 279、GLU 411和ARG442等氨基酸殘基形成氫鍵，氫鍵也是其與酶結(jié)合的主要方式。YG-18可能會(huì)與酶結(jié)構(gòu)中的GLN 279、ARG 315、GLU 411、ASN 415和ARG 442氨基酸殘基形成氫鍵；除氫鍵外，其可能還與ASP 69、ASP 215、GLU 277氨基酸殘基形成范德華力。YG-18展現(xiàn)出的α-葡萄糖苷酶抑制活性可能與這樣的結(jié)合方式有關(guān)，且兩種藥物共同結(jié)合的ASP 69、GLU 277、GLN 279、GLU 411、ARG 442等氨基酸殘基可能為抑制活性的關(guān)鍵氨基酸。

圖3 阿卡波糖-α-葡萄糖苷酶結(jié)合體的3D（A）和2D（B）結(jié)構(gòu)Fig 3 3D（A）and 2D（B）structure of acarbose-α-glucosidase

圖4 YG-18-α-葡萄糖苷酶結(jié)合體的3D（A）和2D（B）結(jié)構(gòu)Fig 4 3D（A）and 2D（B）structure of YG-18-α-glucosidase

3.3 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

OECD指導(dǎo)原則下YG-18單次給藥的序列劑量中，未能得出該藥物的LD50。各給藥組給藥后4 h內(nèi)，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為腹瀉，而腹瀉為α-葡萄糖苷酶的主要不良反應(yīng)之一。腹瀉在給藥后12 h內(nèi)全部恢復(fù)。除腹瀉外，各劑量組均無(wú)其他不良反應(yīng)，未出現(xiàn)死亡，根據(jù)全球統(tǒng)一毒性分級(jí)系統(tǒng)（Globally Harmonized Classification System）分類，YG-18可以被認(rèn)為是幾乎無(wú)毒的。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)所有小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，解剖后觀察，發(fā)現(xiàn)各組小鼠除有2只存在腸道梗阻外，其余小鼠器官的形態(tài)、顏色、質(zhì)地都未發(fā)現(xiàn)顯著異常。根據(jù)小鼠發(fā)生腹瀉的毒性反應(yīng)推測(cè)，該藥物的毒性反應(yīng)主要是通過(guò)α-葡萄糖苷酶導(dǎo)致碳水化合物吸收緩慢，從而導(dǎo)致腹瀉。

4 討論

在本次研究中，化合物YG-18降低了蔗糖負(fù)荷后正常ICR小鼠的血糖峰值，并明顯降低了負(fù)荷2 h內(nèi)的血糖濃度-時(shí)間曲線下面積。由此可見(jiàn)，YG-18雖然對(duì)于血糖峰值的影響不如陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖，但是在1 h時(shí)的血糖可以控制在與阿卡波糖相同的水平，且2 h內(nèi)的血糖濃度-時(shí)間曲線下面積顯著下降。在葡萄糖負(fù)荷后，阿卡波糖和YG-18組的血糖均未下降。根據(jù)α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用特點(diǎn)，這證明YG-18是通過(guò)抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶起到降血糖作用的。

本研究利用α-葡萄糖苷酶共結(jié)晶蛋白模型分析了YG-18與α-葡萄糖苷酶相互作用的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)YG-18主要通過(guò)氫鍵、范德華力、π-陰/陽(yáng)離子、π-π相互作用與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，而阿卡波糖中主要的相互作用只有氫鍵和范德華力。兩種藥物通過(guò)不同結(jié)合作用共同抑制的氨基酸殘基主要有ASP 69、GLU 277、GLN 279、GLU 411、ARG 442等，說(shuō)明這些氨基酸殘基可能是藥物對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵氨基酸。

在急性經(jīng)口毒實(shí)驗(yàn)中，雖然本次實(shí)驗(yàn)未能得出該YG-18的LD50值，但是在2000 mg·kg－1，小鼠在14 d內(nèi)均未出現(xiàn)死亡及其他毒性反應(yīng)，各臟器也未出現(xiàn)器質(zhì)性改變，說(shuō)明YG-18在2000 mg·kg－1劑量?jī)?nèi)具有很好的安全性，LD50＞2000 mg·kg－1。

在合成工藝方面看來(lái)，目前，已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖的工業(yè)合成途徑主要為游動(dòng)放線菌（Actinoplanes spp.）發(fā)酵生產(chǎn)[15]，由于是微生物途徑合成生產(chǎn)，在合成過(guò)程中需對(duì)菌株選育、發(fā)酵條件等條件嚴(yán)格控制，合成工藝非常復(fù)雜。與生物合成工藝相比，通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑YG-18的工藝則較為簡(jiǎn)單，且后續(xù)路線優(yōu)化過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，可以大規(guī)模合成，合成純度也可以保證。所以就合成工藝而言，通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑具有很大的優(yōu)勢(shì)。

有研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅有降糖作用，還可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞表面N-糖基化蛋白的表達(dá)抗癌細(xì)胞遷移作用[16]；此外，α-葡萄糖苷酶抑制劑還可以通過(guò)抑制宿主細(xì)胞中參與順序修建病毒包膜糖蛋白N-連接寡糖的α-葡萄糖苷酶從而抑制病毒的復(fù)制，達(dá)到抗病毒作用，現(xiàn)在已被證明可以被其抑制的病毒有登革病毒（DENV），黃熱病病毒（YFV）和寨卡病毒（ZIKV）等[17-19]。現(xiàn)有已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑吸收均較差，只在腸道內(nèi)產(chǎn)生局部作用。然而無(wú)論是抗腫瘤還是抗病毒作用，僅依靠腸道內(nèi)的局部作用顯然是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，如新型α-葡萄糖苷酶抑制劑具有較高的生物利用度，可為后續(xù)開(kāi)發(fā)研究其體內(nèi)抗腫瘤、抗病毒作用提供支持。

綜上所述，本研究為YG-18的降糖作用、潛在抑制機(jī)制和安全性提供了一定的參考和依據(jù)，同時(shí)也為后續(xù)對(duì)于3-[4-（苯基磺酰胺）苯甲酰]-2H-1-苯并吡喃-2-酮母核結(jié)構(gòu)的化合物開(kāi)發(fā)更加強(qiáng)效的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了依據(jù)。