寧停波，李濤，姜宇珺，梁紅寶，姚景春，張貴民*（.山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂73400；.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 76006）

獨(dú)角蓮為天南星科犁頭尖屬植物獨(dú)角蓮（Typhonium giganteumEngl.）的干燥地下塊莖，現(xiàn)主產(chǎn)于河南、甘肅等地區(qū)[1]，在中國(guó)有著悠久的藥用歷史，具有逐寒、祛風(fēng)痰、止痛止痙、解毒散結(jié)之功效，臨床上常用來治療驚風(fēng)癲癇、破傷風(fēng)等癥，民間也用于治療惡瘡、毒蛇咬傷[2]。近年對(duì)獨(dú)角蓮的研究主要集中在其抗惡性腫瘤活性方面，且藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)獨(dú)角蓮具有顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用[3-6]，但其相關(guān)的活性成分卻一直沒有確定[7]。之前該植物化學(xué)成分研究主要集中于脂溶性部位，分離得到的化合物主要有腦苷類、有機(jī)酸、氨基酸等成分[8-10]?；讵?dú)角蓮的水提物具有較好活性[11]，而且該部位化學(xué)成分的研究報(bào)道很少，所以本文采用活性追蹤法利用模式動(dòng)物對(duì)獨(dú)角蓮的水提物進(jìn)行抗腫瘤活性的初步研究。

1 材料

Bruker-600 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；6500Serises Q-TOF質(zhì)譜儀（美國(guó)Aglient公司）；半制備型高效液相色譜儀輸液泵（NP7010）、檢測(cè)器（NU3001）（漢邦科技）和色譜柱（50 mm×200 mm，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；001×7陽離子交換樹脂和201×4陰離子交換樹脂（天津南開化工廠）；薄層硅膠色譜（青島海洋化工廠）；步琪R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；切片機(jī)（上海南掘中藥機(jī)械制造有限公司，QYJ-200）；烘干機(jī)（上?？到≈兴帣C(jī)械制造有限公司，F(xiàn)YJ-8）；粉碎機(jī)（上海市藥材藥材有限公司，F(xiàn)Y320）；離心機(jī)（上海戴寶機(jī)械設(shè)備有限公司，GQ142）；L-精氨酸對(duì)照品（深圳市斯坦德化工科技有限公司，純度≥98%）；其他試劑均為分析純；ICR小鼠4～6周，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011]；S180小鼠腹水瘤細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）；獨(dú)角蓮購自黑龍江省七臺(tái)河，經(jīng)魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李守信高級(jí)工程師鑒定為獨(dú)角蓮Typhonium giganteumEngl.的塊莖，植物標(biāo)本存放于魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

取鮮獨(dú)角蓮塊莖（50.0 kg）切片、烘干、粉碎，過40目篩，加入10倍量水加熱至微沸提取3次，每次提取2 h，合并提取液，加入95%乙醇調(diào)節(jié)醇濃度至30%，醇沉過夜，離心取上清液，減壓濃縮得總浸膏2.2 kg。將總浸膏溶解于純化水中，上樣預(yù)處理好的001×7陽離子交換樹脂柱（15 kg，13 mm×1400 mm），吸附過夜，收集上樣流出液，蒸干得組分Fr.1（1.8 kg）；用純化水沖洗樹脂柱至無色，再用0.5%的氨水洗脫樹脂至無色，收集洗脫液，減壓濃縮至干膏，即得獨(dú)角蓮水提液的活性部位Fr.2（103.1 g）。Fr.2用純化水溶解，上樣預(yù)處理好的201×4陰離子交換樹脂柱（15 kg，13 mm×1400 mm），吸附過夜，收集上樣流出液，蒸干得組分Fr.3（63.7 g）；用純化水沖洗樹脂柱至無色，再用0.1%的鹽酸洗脫樹脂至無色，收集洗脫液，減壓濃縮得干膏Fr.4（18.3 g）。Fr.4經(jīng)半制備高效液相色譜分離，甲醇-水（5∶95）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，純化得化合物1（198.3 mg，流速1 mL·min－1，tR＝3.715 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶，mp 244℃；1H NMR（600 MHz，D2O）δ：1.59（1H，m，H-2），1.80（1H，d，H-5），3.27（1H，t，H-6）；13C NMR（150 MHz，D2O）δ：157.67（C-1），40.39（C-2），23.78（C-3），28.48（C-4），54.22（C-5），179.38（C-6）；ESI-MS：m/z175.1 [M＋H]－。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，在相同TLC、HPLC條件下，化合物1與L-精氨酸對(duì)照品的Rf值、顯色情況以及出峰時(shí)間完全一致，故鑒定化合物1為L(zhǎng)-精氨酸。

4 對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤抑制活性

4.1 對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的體內(nèi)抑瘤活性檢測(cè)

體外培養(yǎng)S180細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)·mL－1，取0.2 mL接種于備用小鼠的腹腔，形成腹水，按以下方法傳代：脫頸處死荷瘤小鼠，放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡5～10 min，將消毒后的小鼠放入超凈工作臺(tái)中，暴露腹部，無菌條件下，抽取小鼠腹水，1000 r·min－1離心5 min，生理鹽水清洗5遍，去除蛋白等雜質(zhì)，用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)·mL－1，0.2 mL接種于備用小鼠的腹腔，待生成腹水后重復(fù)傳代步驟。取2～3代狀態(tài)良好的乳白色腹水離心后，生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)·mL－1，每只0.2 mL接種于實(shí)驗(yàn)小鼠腋下。

將上述已造模的小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為21組，每組10只，分別為：模型組和不同劑量給藥組；給藥組組分Fr.1、Fr.2按表1所列劑量給藥，組分Fr.3、Fr.4按表2所列劑量給藥，化合物1、L-精氨酸按表3所列劑量給藥。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，模型組給予等體積純化水，1次·d－1，連續(xù)10 d。分組后連續(xù)給藥，待模型組腫瘤直徑長(zhǎng)至1.2～1.5 cm停藥，麻醉放血，剖檢小鼠，稱取小鼠腫瘤質(zhì)量。抑瘤率＝（模型組瘤質(zhì)量－用藥組瘤質(zhì)量）/模型組瘤質(zhì)量×100%。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.2 獨(dú)角蓮水提液活性部位的抑瘤活性

由表1可知，組分Fr.2中、高劑量均能顯著抑制小鼠S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為48.15%和53.70%，而組分Fr.1（001樹脂上樣流出液）不具有抑瘤活性或活性很低。

表1 組分Fr.1和Fr.2對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 1 Anti-tumor effect of Fr.1 and Fr.2 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

表1 組分Fr.1和Fr.2對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 1 Anti-tumor effect of Fr.1 and Fr.2 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05（Compared with the model group，*P＜0.05）。

組別劑量/（g·kg－1）瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組－1.62±0.26－Fr.1不同劑量組21.32±0.31－3.14 4 1.39±0.22 0.61 8 1.24±0.32－8.17 Fr.2不同劑量組20.86±0.31 39.63 4 0.84±0.33* 48.15*8 0.75±0.23* 53.70*

由表2可知，組分Fr.2繼續(xù)用201×4陰離子交換樹脂柱處理所得組分Fr.4，在低、中、高劑量抑瘤率分別為45.28%、50.31%和55.35%，而組分Fr.3（201×4樹脂上樣流出液）不具有抑瘤活性或活性很低（抑瘤率≤23.47%）。

表2 組分Fr.3和Fr.4對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 2 Anti-tumor effect of Fr.3 and Fr.4 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

表2 組分Fr.3和Fr.4對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 2 Anti-tumor effect of Fr.3 and Fr.4 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05（Compared with the model group，*P＜0.05）。

組別劑量/（mg·kg－1）瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組－1.59±0.33－Fr.3不同劑量組2001.64±0.3214.12 4001.63±0.3318.35 8001.72±0.3323.47 Fr.4不同劑量組2000.87±0.3545.28 4000.79±0.31*50.31*8000.71±0.22**55.35**

由以上數(shù)據(jù)可以可知，獨(dú)角蓮提取物經(jīng)過抑瘤活性追蹤和離子交換樹脂分離純化后，得到的組分Fr.4仍具有顯著的抑瘤活性。

4.3 L-精氨酸的抑瘤活性

獨(dú)角蓮化合物1與同等劑量的L-精氨酸對(duì)照品對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果顯示，中、高劑量L-精氨酸能夠顯著抑制小鼠S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為48.17%、55.48%。表明L-精氨酸在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤具有劑量依賴性，且與同等劑量的獨(dú)角蓮化合物1組分效果相當(dāng)（見表3）。

表3 化合物1和L-精氨酸對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 3 Anti-tumor effect of compound 1 and L-arginine on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

表3 化合物1和L-精氨酸對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 3 Anti-tumor effect of compound 1 and L-arginine on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（Compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01）。

組別劑量/（mg·kg－1）瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組－3.01±0.33－化合物1 82.18±0.3127.57 241.53±0.25*49.20*721.33±0.22**55.81**L-精氨酸 82.21±0.3326.58 241.56±0.22*48.17*721.34±0.29*55.48*

5 討論

大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)獨(dú)角蓮水煎液具有顯著的抗腫瘤活性，但到目前為止其有效成分仍不明確。為了對(duì)獨(dú)角蓮的抗腫瘤活性成分進(jìn)行研究，本課題組摸索過提取其他成分，諸如皂苷和多糖類成分，但經(jīng)荷瘤小鼠S180抗腫瘤實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)現(xiàn)其活性很低甚至沒有。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過對(duì)獨(dú)角蓮提取物抑瘤活性研究初步確定了Fr.1和Fr.2給藥劑量范圍2～8 g·kg－1、Fr.3和Fr.4給藥劑量范圍200～800 mg·kg－1、化合物1和精氨酸給藥劑量范圍8～24 mg·kg－1。本文在上述工作的基礎(chǔ)上，選擇抗腫瘤活性顯著的大極性水提液進(jìn)行研究，最終經(jīng)HPLC純化得單體化合物1，經(jīng)鑒定其為L(zhǎng)-精氨酸，用同等劑量的L-精氨酸對(duì)照品作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)抑瘤活性與化合物1基本一致。該實(shí)驗(yàn)初步證明獨(dú)角蓮抗腫瘤活性的有效成分之一是L-精氨酸。

張劍等[13-14]均報(bào)道L-精氨酸具有一定的抗腫瘤活性；Grossie等[15]認(rèn)為，小劑量和過高劑量L-精氨酸均能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，只有合適劑量才能抑制腫瘤；也有報(bào)道認(rèn)為L(zhǎng)-精氨酸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無影響，但可促進(jìn)化療藥物發(fā)揮療效[16]。鑒于此，L-精氨酸的抗腫瘤活性作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究和探討。

本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)活性追蹤法對(duì)獨(dú)角蓮抗腫瘤有效成分進(jìn)行了追蹤，最終找到了具有抗腫瘤作用的活性成分之一——L-精氨酸，但由于L-精氨酸抗腫瘤機(jī)制不明，不排除是多種成分協(xié)同作用產(chǎn)生活性的可能性。本文為獨(dú)角蓮抗腫瘤活性研究提供一定的參考，如需明確抗腫瘤機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。