陶林，吳霜，文建文，韋立志（.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 藥物臨床試驗機構(gòu)辦公室，南寧 530007；.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南寧 530007；3.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥學部，南寧 530007）

肝癌新發(fā)病例全球每年約有78萬，其死亡率僅次于肺癌，排名第二[1]。我國肝癌的5年生存率僅為10.1%，一經(jīng)確診已為晚期[2]。肝癌患者主要以放療、化療為最主要的有效治療手段。順鉑因抗瘤譜廣、療效顯著已經(jīng)成為治療多種惡性腫瘤的臨床一線用藥，其抗腫瘤作用與DNA損傷和DNA合成抑制相關(guān)，主要通過激活細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞死亡。近年來中醫(yī)藥在腫瘤治療方面取得了較好的成果[3]。壯藥矮陀陀原植物（Munronia henryi）又稱小地黃連、小獨根、千年矮、思茅地黃連等，其味甘微苦，性涼，具有清熱解毒、活血止痛的功效。廣西民間常用其全草臼爛水煎內(nèi)服治療腹痛、風濕痛等[4]，還可用于治療跌打瘀痛、感冒發(fā)熱、咽喉炎、癰腫疔瘡[5]。劉越滇等[6]發(fā)現(xiàn)矮陀陀乙醇提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎活性。Lin 等[7]發(fā)現(xiàn)矮陀陀提取物具有抑菌活性，其中mulavanin D和2α，3α，15β-trihydroxy-20（S）-tigloyl-pregnane對紅色毛廯菌的MIC（最低抑菌濃度）分別為 25、50 μg·mL－1。此外，矮陀陀具有抗病毒活性，能抑制煙草花葉病毒（TMV）的復制。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)矮陀陀中分離所得檸檬苦素衍生物具有抗腫瘤活性，能顯著抑制HL-60、H22、A-549、MCF-7、SW480 等5種癌細胞株增殖。Qi等[9]的研究表明矮陀陀提取物具有較強的抗腫瘤活性，能夠抑制肺癌細胞A549的增殖（抑制率32.8%），并誘導腫瘤細胞凋亡。矮陀陀在體內(nèi)是否具有抗腫瘤活性尚未見報道，本研究擬探究矮陀陀含藥血清對小鼠肝癌H22細胞株的增殖影響及機制，闡明矮陀陀的抗腫瘤活性及可能機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞與動物

小鼠肝癌細胞株H22購于中國醫(yī)學科院腫瘤醫(yī)院（廣西醫(yī)科大學藥理教研室傳代保存）。SPF級雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量180～220 g，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心SPF動物房，動物許可證號：SCXK桂2014-0002。

1.2 試藥

壯藥矮陀陀，采自廣西靖西縣，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥鑒定室文建文主管藥師鑒定為楝科植物地黃連屬云南地黃連Munronia delavayiFranch.干燥全株，注射用順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：20 mg，批號：150701），DMEM培養(yǎng)液（Sigma公司），F(xiàn)BS（胎牛血清，杭州四季青生物公司），胰蛋白酶消化液（Hyclone公司），青霉素鏈霉素混合液（Solarbio公司），MTT（四甲基偶氮唑藍）檢測試劑盒（科昊生物公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司），caspase-3（細胞凋亡蛋白酶）檢測定量試劑盒（abcamab公司），TRIzol裂解液（Invitrogen公司），Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（翊圣生物公司）。PCR引物設(shè)計由擎科生物公司設(shè)計，見表1及表2。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab 1 Quantitative real-time PCR primer sequence

表2 PCR反應(yīng)體系Tab 2 Reaction system of PCR

1.3 儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱（Heal Force公司），流式細胞儀（Beckman公司），低溫高速離心機（Eppendorf公司），倒置顯微鏡（Nikon公司），熒光顯微鏡（Olympus公司），定量PCR儀（Applied Biosystems公司），酶聯(lián)免疫檢測儀、Gel Image System凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 矮陀陀含藥血清制備

將4 kg藥材切成直徑0.5 cm左右的細條后用水提取（加入8倍量的純凈水先冷浸1 h，再文火加熱回流2 h，提取2次，過濾，合并濾液）；提取液濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行旋蒸濃縮為8 mg·mL－1的生藥液冷藏備用。使用時再配制成相應(yīng)的濃度。

取SPF級雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量180～220 g，隨機分成5組，每組5只，分別為空白對照組、陽性對照組、低劑量給藥組、中劑量給藥組和高劑量給藥組?？瞻讓φ战M灌胃給予生理鹽水，陽性對照組灌胃給予順鉑（1 mg·kg－1），低、中、高劑量組分別按20、40、80 mg·kg－1灌胃給予由生理鹽水配制的生藥液；每日給藥2次，每次1 mg·mL－1，連續(xù)給藥5 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，以0.003 g·mL－1水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血。血液室溫放置4 h后，待血塊凝結(jié)，3000 r·min－1離心20 min，吸取上部血清得到含藥血清。同組動物血清合并，經(jīng)56℃滅活30 min，于無菌環(huán)境中用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，置冰箱－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 H22細胞培養(yǎng)

H22細胞以1×105個/孔的濃度接種于96孔板中，10%FBS的DMEM作為培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每日換液一次，待細胞長至80%時采用胰蛋白酶消化液進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.3 MTT法檢測細胞增殖情況

將對數(shù)生長期的H22細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜。待其貼壁后，棄去上層培養(yǎng)基，分別加入含15%不同含藥血清的培養(yǎng)基（根據(jù)前期文獻調(diào)研及預實驗確定），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入20 μL 5 mg·mL－1的MTT孵育4 h，棄去全部液體，每孔加入200 μL DMSO，搖床震蕩10 min 后，酶標儀在492 nm處測定吸光度值，每孔設(shè)定5個復孔，細胞抑制率＝（OD空白對照組－OD實驗組）/OD空白對照組×100%。

2.4 Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

將對數(shù)生長期的H22細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3”項下方法加藥培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶室溫消化細胞3 min，1000 r·min－1離心3 min，棄去上清液。細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍后，用500 μL Binding Buffer重懸，依次加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL PI（碘化丙啶）混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.5 RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3表達情況

將對數(shù)生長期的H22細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3”項下方法加藥培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶室溫消化，1000 r·min－1離心3 min，棄去上清液，細胞用PBS清洗2遍，收集細胞按照TAKARA試劑盒說明書提取mRNA，PCR條件：94℃預變性 2 min，“94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s”×35 個循環(huán)，72℃終延伸 2 min。以β-actin為內(nèi)參與空白對照組進行相對定量，計算方法采用2－△△ct計算相對定量結(jié)果。

2.6 蛋白提取以及Western Blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達

將對數(shù)生長期的H22細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3”項下方法加藥培養(yǎng)24 h。加入100×蛋白酶抑制劑0.8 μL和80 μL RIPA反復吹打裂解，冰上裂解15 min后12 000 r·min－1、4℃離心10 min。取上清液，加入五分之一體積的5×蛋白上樣緩沖液，沸水加熱5 min變性，－20℃保存。BCA試劑盒定量后，將蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠 100 V 電泳約 1 h，電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)（80 V）2 h，電轉(zhuǎn)至 PVDF（聚偏氟乙烯）膜，4%脫脂奶粉 37℃封閉2 h，搖床搖勻，加入抗體Caspase3（1∶1000 稀釋）、Bax 抗體（1∶1000 稀釋）、Bcl-2（1∶1000 稀釋）、β-actin（1∶2000稀釋），4℃搖床過夜。1% TBST洗膜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，1% TBST洗膜后加入適宜劑量的 ECL 顯色液在暗室凝膠成像儀下曝光成像，并用 Image J 軟件進行圖像分析。

2.7 Caspase-3 的免疫熒光染色

將對數(shù)生長期的H22細胞以2×104個/孔接種于放有蓋玻片的24孔板中，按“2.3”項下方法加藥培養(yǎng)24 h。玻片用PBS清洗2次，每次2 min。室溫下用4%多聚甲醛孵育10 min固定細胞。磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）清洗細胞2次，每次2 min；PBS-5% Tween 20浸潤10 min；PBST清洗細胞2次，每次2 min；5% FBS室溫封閉1 h；人源Caspase-3抗體按1∶100比例稀釋用5% FBS稀釋后，取20 μL加入細胞室溫孵育2 h；PBST清洗細胞2次，每次2 min；加入按1∶100比例用5% FBS稀釋的山羊抗人的異硫氰酸熒光素（FITC）標記IgG二抗，室溫孵育1 h；PBST清洗細胞2次，每次2 min；細胞用5 μg·mL－14'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫孵育1 h復染；最后用甘油封閉后，激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍照；用Image J軟件測量熒光強度，GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學分析。

2.8 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 矮陀陀抑制H22的增殖

結(jié)果如表3所示，與空白對照組比較，矮陀陀含藥血清對H22細胞的增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），并且隨著矮陀陀給藥劑量的增加，抑制率顯著增加。

表3 含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清對H22增殖的影響(n＝5)Tab 3 Effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on H22 proliferation (n＝5)

3.2 矮陀陀含藥血清可促進H22細胞的凋亡

矮陀陀含藥血清和順鉑含藥血清均能誘導H22細胞凋亡（見圖1）。隨著矮陀陀給藥劑量的增加，凋亡細胞的數(shù)量顯著增加，見表4。

圖1 Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清分別在不同時間對H22凋亡的影響Fig 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry for determing the effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on H22 apoptosis at different time

表4 含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清對H22凋亡的影響(n＝3)Tab 4 Effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on H22 apoptosis (n＝3)

3.3 矮陀陀含藥血清對Bax、Caspase-3和 Bcl-2的mRNA表達水平的影響

與空白對照組相比，順鉑能顯著增加H22細胞中Bax和Caspase-3的mRNA水平，并且顯著降低Bcl-2的mRNA水平。不同劑量的矮陀陀含藥血清具有類似的作用，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，隨著矮陀陀給藥劑量的增加，Bcl-2的mRNA水平逐漸降低，Bax和Caspase-3的mRNA水平逐漸增加，結(jié)果見表5。

表5 含順鉑、不同劑量矮陀陀血清對H22細胞Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA相對表達量的影響(n＝3)Tab 5 Effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on relative expression levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA in H22 cells (n＝3)

3.4 矮陀陀含藥血清對Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達的影響

與空白對照組相比，矮陀陀含藥血清和順鉑含藥血清都能顯著增加H22細胞中Bax和Caspase-3的蛋白表達，并且顯著抑制Bcl-2的蛋白表達。隨著矮陀陀濃度的增加Bax/Bcl-2比值逐漸增加，在高劑量時差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.005），表明矮陀陀可能通過增加Bax/Bcl-2促進腫瘤細胞的凋亡。結(jié)果如圖2所示。

圖2 Western Blot檢測含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清處理后H22細胞中Bcl2、Bax和Caspase-3表達情況Fig 2 Western Blot in detecting the expression of Bcl2，Bax and Caspase-3 in H22 cells treated with serum containing containing cisplatin and different doses of Munronia henryi

3.5 免疫熒光檢測矮陀陀可增加Caspase-3蛋白的表達

如圖3A所示，相對于空白對照組，陽性對照組和矮陀陀高劑量組Caspase-3熒光強度顯著增加（P＜0.01），這一結(jié)果與Western Blot中的陽性對照組和矮陀陀高劑量組Caspase-3表達量顯著增加一致，如圖3B所示，隨著矮陀陀劑量的增加Caspase-3熒光強度也逐漸增加，呈劑量依賴性。

圖3 免疫熒光檢測含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清處理后H22細胞中Caspase-3的表達情況（標尺＝50 μm）Fig 3 Immunofluorescence was used to detect the expression of Caspase-3 in H22 cells treated with serum containing cisplatin and different doses of Munronia henryi（scale＝50 μm）

4 討論

本實驗涉及的矮陀陀供試液為其水提粗提物。含藥血清為實驗動物經(jīng)灌胃給藥一定時間后采集到的動物血清，適宜于研究成分復雜的中草藥藥理藥效。采集含藥血清進行實驗使中藥藥效的研究不再局限于整體的功能研究，而是根據(jù)體內(nèi)有效藥物的主要存在部位，結(jié)合細胞學和分子生物學手段，從基因、基因產(chǎn)物、藥物受體和酶活性等方面闡述藥物作用機制[10]。采用血清藥理學的研究方法，在藥物體外活性研究時能在一定程度上排除粗提物其他因素的干擾，使結(jié)果更為可靠[11]。含中藥的血清可直接用于體外研究，所反映的實驗結(jié)果更為客觀具體，為中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的研究拓寬了思路，提供了新的方法。然而，該方法起步較晚，仍然存在一些不足，首先在含藥血清的制備過程中，給藥劑量、采血時間和動物模型都沒有嚴格的規(guī)定，標準不統(tǒng)一，無法進行標準化制訂，為解決這一問題，在實驗開啟前需要查閱文獻并結(jié)合預實驗，才能最大程度地提高實驗結(jié)果的客觀性。其次當藥物進入體內(nèi)血液循環(huán)，經(jīng)過代謝可能轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物，導致最終進入血液的不是藥物原形成分，為解決這一問題，可與藥物分析、藥代動力學、藥物化學等專業(yè)結(jié)合，聯(lián)合采用質(zhì)譜、液相、核磁等分析手段，進一步完善和發(fā)展血清藥理學。

本研究結(jié)果證明，矮陀陀可抑制肝癌細胞株H22增殖并促進其凋亡（P＜0.05）。線粒體中凋亡分子Apaf-1釋放與細胞色素C相互作用激活Caspase-3信號轉(zhuǎn)導[12]，激活后的Caspase-3、PARP1、Bcl-2和Bax可直接激活上述一種或幾種凋亡通路，誘導細胞凋亡[13]。本研究中矮陀陀處理后Caspase-3的顯著升高是其導致H22凋亡的主要原因。Bax/Bcl-2比值對于細胞是否進入凋亡狀態(tài)有決定意義，Bcl-2分布在細胞質(zhì)中調(diào)控線粒體膜的通透性，通過降低線粒體膜電位、抑制細胞色素C釋放以及Caspase-3激活從而對凋亡產(chǎn)生負調(diào)控[14]；Bax作用正好相反，當期構(gòu)象發(fā)生改變時，進入線粒體并破壞線粒體膜，釋放細胞色素C，激活Cyt C/Caspase-9信號通路，對細胞凋亡起正調(diào)控[15]。Bcl-2和Bax之間形成異源二聚體，Bax/Bcl-2比值增加可促進細胞凋亡，降低則抑制細胞凋亡，故矮陀陀含藥血清促進H22凋亡可能與激活Bax和Caspase-3表達，以及增加Bax/Bcl-2比值有關(guān)。有大量研究指出多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Bax、Bcl-2密不可分，如Albamonte等[16]檢測了215例卵巢癌患者中Bax和Bcl-2表達情況，Bax陽性率為30%，Bcl-2陽性率為47%，Bax陽性者的預后優(yōu)于Bax陰性者；Bcl-2陽性者預后不如Bcl-2陰性者。崔運浩等[17]研究也證明黃芪多糖能明顯增加人胃癌細胞中Bax/Bcl-2比值，從而誘導胃癌細胞凋亡。

綜上所述，矮陀陀能抑制H22細胞增殖，并且通過激活Bax和Caspase-3表達，以及增加Bax/Bcl-2比值誘導腫瘤細胞凋亡。