馬雪潔，程路峰，楊淑梅*，何雯（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 8300；.成都市第五人民醫(yī)院，成都 630）

異葉青蘭（Dracocephalum heterophyllumBenth）別名白花夏枯草、甜蜜罐、龍頭草、白花梔子花，為唇形科青蘭屬多年生草本植物，在我國主要分布于新疆、內(nèi)蒙古、西藏、青海、寧夏、甘肅等地。研究發(fā)現(xiàn)異葉青蘭含有揮發(fā)油類、黃酮類、有機(jī)酸類、生物堿類、多糖類、萜類、木質(zhì)素類等化學(xué)成分[1-3]。主要用于高血壓、支氣管炎、肺熱、肝火頭痛、淋巴結(jié)炎、口腔潰瘍等[4-7]。近年來有研究表明，異葉青蘭的提取物具有抗高血壓、心血管保護(hù)、抗缺氧、抗病毒等藥理作用[8-9]，但對其抗氧化作用研究較少，因此本實驗通過回流提取、純化制備異葉青蘭中總黃酮，采用硝酸鋁比色法進(jìn)行含量測定，通過檢測異葉青蘭總黃酮清除DPPH、ABTS自由基能力和總抗氧化能力，評價其體外抗氧化活性，以期為該藥材的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

異葉青蘭采自新疆阿克陶縣，經(jīng)中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所沈觀冕研究員鑒定為青蘭屬植物異葉青蘭全草。

亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁對照品（批號：SR8250，含量≥98%）、維生素C對照品（批號：SV2180，純度＞98%）（中國食品藥品檢定研究院）；ABTS自由基清除能力檢測試劑盒（貨號：BC1315）、總抗氧化能力檢測試劑盒（貨號：BC4770）（北京索萊寶科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京化成工業(yè)株式會社，純度＞97%）。

1.2 儀器

N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海泉杰儀器有限公司）；YB202N電子天平（上海怡臺電子科技有限公司）；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；島津UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；Multiskan GO型全自動酶標(biāo)儀（Thermo美國）；KQ3200D型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 異葉青蘭總黃酮的提取與純化

根據(jù)課題組前期研究確定的提取工藝，取異葉青蘭全草1 kg，粉碎，加入70%乙醇（料液比＝1∶40，g/mL），50℃加熱回流提取3次，每次提取2 h，收集3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。用適量蒸餾水稀釋上述濃縮后的液體，以70%乙醇作為洗脫劑，AB-8大孔吸附樹脂層析柱洗脫純化，收集純化后的液體，旋蒸濃縮后冷凍干燥，粉碎備用，異葉青黃酮得率為3.6%。

2.2 溶液的制備

2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱量蘆丁對照品10 mg用70%乙醇充分溶解，并定容至50 mL，搖勻備用，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL－1的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取異葉青蘭總黃酮粉末0.1 g，加入70%乙醇，超聲溶解，并定容至50 mL，搖勻備用，即得質(zhì)量濃度為2 mg·mL－1的異葉青蘭總黃酮溶液。

2.2.3 顯色溶液的制備

① 5% NaNO2溶液的制備：精密稱量亞硝酸鈉2.5 g，加入蒸餾水，充分溶解并定容至50 mL，搖勻備用。

② 10% Al（NO3）3溶液的制備：精密稱量硝酸鋁5.0 g，加入蒸餾水，充分溶解并定容至50 mL，搖勻備用。

③ 4% NaOH溶液的制備：精密稱量氫氧化鈉4.0 g，加入蒸餾水，充分溶解并定容至100 mL，搖勻備用。

④ 0.04 mg·mL－1的DPPH溶液的制備：精密稱取DPPH粉末4.0 mg，用95%乙醇溶解定容至100 mL，搖勻備用。

2.3 顯色方法及最大吸收波長選擇

參考文獻(xiàn)[10]方法，精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液各1 mL置于25 mL量瓶，分別加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入4% NaOH溶液10 mL搖勻，并用70%乙醇定容至25 mL，靜置30 min。以70%乙醇為空白溶液，于400～800 nm波長處掃描各溶液，確定最大吸收波長為510 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，按“2.3”項下顯色方法依次加入顯色溶液，以顯色后的空白對照溶液調(diào)零，于λ＝510 nm處測定吸光度值，以蘆丁對照品溶液質(zhì)量濃度（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y＝12.08X－0.0103，R2＝0.9997。結(jié)果表明，蘆丁對照品質(zhì)量濃度在0.008～0.048 mg·mL－1內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下蘆丁對照品2 mL，按“2.3”項下顯色方法依次加入顯色溶液，于λ＝510 nm波長處，連續(xù)重復(fù)6次測定蘆丁對照品吸光度，根據(jù)結(jié)果計算RSD為0.12%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱量異葉青蘭總黃酮樣品50.0 mg，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取0.5 mL，按“2.3”項下方法顯色，于λ＝510 nm波長處測定6份供試品溶液的吸光度，根據(jù)結(jié)果計算RSD為1.9%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取0.5 mL供試品溶液，按“2.3”項下方法室溫放置顯色，以顯色后的空白對照溶液調(diào)零，分別在0、15、30、45、60 min時測定供試品溶液吸光度，根據(jù)結(jié)果計算RSD為1.6%（n＝6），表明供試品在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 含量測定

精密稱量異葉青蘭總黃酮粉末50.0 mg，按“2.2.2”項下方法制備異葉青蘭總黃酮溶液，精密量取0.5 mL，按“2.3”項下顯色方法進(jìn)行顯色，于λ＝510 nm波長處測定吸光度值。并將吸光度代入線性回歸方程，按下式計算異葉青蘭總黃酮含量?？傸S酮含量（%）＝（C×V1×V3）/（V2×W）×100%，結(jié)果異葉青蘭總黃酮的平均含量為48.6%。其中C為總黃酮濃度，V1為異葉青蘭總黃酮供試品母液體積，V2為從供試品母液中量取的體積，V3為測定時溶液的總體積，W為稱取總黃酮樣品的質(zhì)量。

2.6 異葉青蘭總黃酮體外抗氧化活性測定

2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[11]的方法，并稍作調(diào)整。精密吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的異葉青蘭總黃酮于試管中，分別加入2 mL DPPH溶液，將其混合搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測得樣品吸光度值A(chǔ)樣品。吸取75%乙醇1 mL，再加入95%乙醇2 mL，混勻后，517 nm處測得吸光度值A(chǔ)對照。吸取1 mL75%乙醇于試管內(nèi)，再加入2 mL DPPH溶液，測得其吸光度值A(chǔ)空白。同法精密移取1 mL不同質(zhì)量濃度維生素C作為樣品溶液，用1 mL的蒸餾水替代樣品溶液，分別加入2 mL DPPH或95%乙醇作為空白或?qū)φ?，測得吸光度。按下式分別計算異葉青蘭總黃酮和維生素C對DPPH自由基的清除率。DPPH自由基的清除率（%）＝[A空白－（A樣品－A對照）]/A對照×100%。結(jié)果當(dāng)異葉青蘭總黃酮的質(zhì)量濃度為0.01～0.6 mg·mL－1時，隨著質(zhì)量濃度的增大，異葉青蘭總黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)，且有較為顯著的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg·mL－1時，其清除率高達(dá)82.94%。而當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6 mg·mL－1時，其對DPPH自由基的清除率增長幅度逐漸變小。與維生素C相比，異葉青蘭總黃酮對DPPH自由基的清除能力稍弱。通過SPSS 21.0 軟件分析，異葉青蘭總黃酮和維生素 C 清除DPPH自由基的IC50值分別為0.063 mg·mL－1和0.012 mg·mL－1（見圖1）。

圖1 異葉青蘭總黃酮對DPPH自由基清除率曲線Fig 1 Scavenging rate curve of the total flavonoids of Dracocephalum heterophyllum Benth on DPPH free radicals

2.6.2 ABTS自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[12]按照試劑盒說明配制ABTS工作液并按步驟進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至405 nm測定。按下式分別計算異葉青蘭總黃酮和維生素C的ABTS自由基清除能力。ABTS自由基清除率（%）＝[A空白－（A樣品－A對照）]/A空白×100%。結(jié)果當(dāng)質(zhì)量濃度為0.01～0.4 mg·mL－1時，隨著質(zhì)量濃度的增大，異葉青蘭總黃酮對ABTS自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，有明顯的量效關(guān)系。且質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL－1時，其清除率可高98.48%。而當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.4 mg·mL－1時，其對ABTS 自由基的清除率的增長趨勢逐漸變緩。當(dāng)維生素C 的質(zhì)量濃度在0.01～1 mg·mL－1時，隨著質(zhì)量濃度的增大，其清除自由基能力也增大，且當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1時，清除率高達(dá)98.42%。而當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.1 mg·mL－1時，其對ABTS 自由基的清除率的增長趨勢逐漸變緩。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg·mL－1時，其清除ABTS自由基的能力與維生素C 相當(dāng)。通過SPSS 21.0 軟件分析，異葉青蘭總黃酮和維生素C清除ABTS自由基的IC50值分別為0.079 mg·mL－1和0.028 mg·mL－1（見圖2）。

圖2 異葉青蘭總黃酮對ABTS 自由基清除率曲線Fig 2 Scavenging rate curve of the total flavonoids of Dracocephalum heterophyllum Benth on ABTS free radicals

2.6.3 總抗氧化能力測定 按照試劑盒說明進(jìn)行操作，制備40 μmol·mL－1FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其用蒸餾水稀釋至不同濃度梯度，提前30 min預(yù)熱酶標(biāo)儀，調(diào)節(jié)波長至593 nm測定測定吸光度，以Fe2＋終濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按下式分別計算異葉青蘭總黃酮和維生素C 總抗氧化能力?？偪寡趸芰Γé蘭ol·mL－1）＝X×V反總/V樣＝34X，其中V反總指反應(yīng)總體積，V樣為反應(yīng)中樣本體積。以Fe2＋終濃度為橫坐標(biāo)，以△A為縱坐標(biāo)（其中△A指樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值），X指樣品扣除空白后的吸光度代入回歸方程得到的Fe2＋當(dāng)量（μmol·L－1）。結(jié)果在本實驗研究濃度范圍內(nèi)，隨著異葉青蘭總黃酮質(zhì)量濃度的增大，其總抗氧化能力也增大，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg·mL－1時，其總抗氧化能力值為5.81 μmol·mL－1。隨著質(zhì)量濃度的增大，維生素C總抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg·mL－1時，其總抗氧化能力值為10.79 μmol·mL－1，是相同濃度異葉青蘭總黃酮總抗氧化能力的1.86倍，故維生素C的總抗氧化能力強(qiáng)于異葉青蘭總黃酮（見圖3）。

圖3 異葉青蘭總黃酮總抗氧化能力Fig 3 Total antioxidant capacity of total flavonoid of Dracocephalum heterophyllum Benth

3 討論

本實驗采用70%乙醇加熱回流提取、純化得到異葉青蘭總黃酮提取物。通過硝酸鋁比色法測定異葉青蘭總黃酮含量，測得異葉青蘭總黃酮平均含量為48.6%，所建立的方法操作簡便。近年來，大量研究表明，許多疾病的發(fā)生都與自由基以及人體氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)[13]。自由基是一種由機(jī)體氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的具有較強(qiáng)的氧化性的有害化合物，它能損害人體的組織和細(xì)胞，并引起多種慢性疾病的發(fā)生[14]。DPPH是一種性質(zhì)穩(wěn)定且其醇溶液顯深紫色的自由基，該自由基在517 nm處存在吸收峰[15]。ABTS自由基清除能力檢測法可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定。經(jīng)氧化后的ABTS可生成穩(wěn)定的ABTS＋自由基，該陽離子呈藍(lán)綠色，在405 nm或734 nm波長處有最大吸收峰[16]。本實驗通過檢測異葉青蘭總黃酮清除DPPH、ABTS自由基的能力以及總抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)異葉青蘭總黃酮質(zhì)量濃度與其清除自由基以及抗氧化能力之間存在一定的量效關(guān)系，提示可以對該藥材在抗氧化方面的應(yīng)用做更深入的研究。