張 銳，顧志榮，呂 鑫，葛 斌

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2. 甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

紅芪是豆科植物多序巖黃芪的干燥根，功能補(bǔ)氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌[1]。紅芪主要分布在甘肅的六盤山及南部山地處，與黃芪同科異屬，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中黃芪項(xiàng)下，同被列為上品。紅芪與黃芪的功效大致相同，但在物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理藥效方面存在一定差異[2]。紅芪以其復(fù)雜的化學(xué)成分、多重的藥理作用及巨大的治療價(jià)值受到廣泛關(guān)注。研究表明，紅芪的主要化學(xué)成分有皂苷類、黃酮類、苯丙素類、糖苷類、多糖、氨基酸、微量元素等，具有抗氧化[3]、促生長(zhǎng)[4]、調(diào)節(jié)免疫[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]、神經(jīng)保護(hù)[8]、抗老年癡呆[9]、保護(hù)心肌[10]、抗骨質(zhì)疏松[11]、抗貧血[12]、抗衰老[13]等廣泛的藥理作用，其中抗腫瘤、治療糖尿病并發(fā)癥、抗骨質(zhì)疏松及化學(xué)成分與藥理作用的“譜-效”關(guān)系等是目前研究的熱點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來隨著“互聯(lián)網(wǎng)+大數(shù)據(jù)”的快速發(fā)展而興起的交叉學(xué)科，它通過系統(tǒng)、綜合的思路探討“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間的深層次、全面的作用機(jī)制，與中醫(yī)藥的整體性、系統(tǒng)性思維完全契合，是近年來快速發(fā)展的研究中醫(yī)藥復(fù)雜作用的有力工具[14]。紅芪的活性成分種類較多且復(fù)雜，藥理作用較為廣泛，開發(fā)利用價(jià)值較大，在多種疾病治療中顯示了很大的潛力，因此有必要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)其活性成分、作用靶點(diǎn)及潛在的治療價(jià)值進(jìn)行深入梳理與探討，為其進(jìn)一步研究提供有益思路。

1 資料與方法

1.1 分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp. nwu. edu. cn/tcmsp. php)，UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. uniprot. org)，Swiss Target Prediction服務(wù)器(http://www. swisstargetprediction. ch/)，String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db. org/Version 10.5)，Cytoscape 3.6.0軟件，David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david. ncifcrf. gov/home. Jsp)。

1.2 活性成分的篩選

TCMSP[15]采用的是HIT數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)算法SysDT來獲得藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)系，在TCMSP中可獲取每種藥物的藥代動(dòng)力學(xué)信息，如類藥性(Drug like，DL)、口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)、血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)、腸上皮通透性(Intestinal epithelial cells，Caco-2)、脂水分配系數(shù)(Lipid-water partition coefficient，ALogP)、H鍵供體/受體(H bond donor/acceptor，H don/H acc)等。OB指藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度，DL指化合物與已知藥物的相似性。通過操作TCMSP收集、整理紅芪中的所有化學(xué)成分，并依據(jù)OB≥30%且DL≥0.18篩選出紅芪中的活性成分。

1.3 候選化合物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

Uniprot(Universal protein resource，UniProt)數(shù)據(jù)庫(kù)被認(rèn)為是收錄最廣泛和注釋信息最全面的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，其數(shù)據(jù)主要來自于基因組測(cè)序項(xiàng)目完成后，后續(xù)獲得的蛋白質(zhì)序列。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將TCMSP挑選出的目標(biāo)蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名，并找出其對(duì)應(yīng)的Uniprot ID，最后匯總整理。

1.4 靶點(diǎn)蛋白的補(bǔ)充

從TCMSP的候選化合物的“Pubchem Cid”中進(jìn)入，在Swiss Target Prediction中利用SMILES格式預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白，將其與“1.3”項(xiàng)所得基因匯總在一起，進(jìn)行收集整理。

1.5 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將“1.4”項(xiàng)得到的基因名進(jìn)行查重，得到潛在靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入String網(wǎng)站中，得到紅芪中的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型圖，將其以TSV格式通過Excel導(dǎo)出后，帶入Cytoscape 3.6.0軟件中，利用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，繪制網(wǎng)絡(luò)圖。將Betweenness Centrality(介數(shù)中心性值，接近中心性高的靶標(biāo)與更多的靶標(biāo)直接相連，表明該靶標(biāo)在不同疾病病機(jī)過程中的重要性)和Degree(結(jié)點(diǎn)中心度，反映與某個(gè)靶標(biāo)共同參與不同疾病病理過程的其他靶標(biāo)數(shù)目)中的數(shù)據(jù)選取高于平均值以上，并將其對(duì)應(yīng)的基因摘出，找出相應(yīng)的Uniprot ID，便得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 靶標(biāo)的GO富集分析及KEGG通路分析

將從“1.5”項(xiàng)中得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)Uniprot ID導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋工具中進(jìn)行分析。進(jìn)入Functional Annotation Chart，下載“Gene Ontology”中的生物過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細(xì)胞組成(Cellular component，CC)，進(jìn)行GO富集分析，并下載“Pathways”中的KEGG_PATHWAYS進(jìn)行KEGG通路分析。

1.7 目標(biāo)疾病的預(yù)測(cè)

將關(guān)鍵靶點(diǎn)的Uniprot ID導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋工具中，操作進(jìn)入Annotation Summary Results界面后，同時(shí)操作“Disease”中的GAD_DISEASE和OMIM_DISEASE，然后進(jìn)入Functional Annotation Chart。將數(shù)據(jù)下載后導(dǎo)入Excel中，再根據(jù)其P值選擇對(duì)應(yīng)的疾病，即為其預(yù)測(cè)的疾病。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，以中藥“紅芪”為“Herb name”搜索紅芪中的所有化學(xué)成分，共得到43個(gè)化學(xué)成分。結(jié)合閾值(OB≥30%且DL≥0.18)篩選后，共得到14個(gè)活性成分。結(jié)果見表1。

表1 紅芪中14個(gè)活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of 14 active compounds in Radix Hedysari

2.2 活性成分-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)整理得到的有關(guān)紅芪的靶點(diǎn)基因共有405個(gè)，將紅芪的Smiles格式上傳到Swiss Target Prediction網(wǎng)站，共得到278個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。對(duì)匯總的靶點(diǎn)基因進(jìn)行查重后，共得到334個(gè)靶點(diǎn)基因。利用String網(wǎng)站對(duì)查重后的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得到紅芪的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型圖(圖1)。分析其網(wǎng)絡(luò)模型圖，發(fā)現(xiàn)有303個(gè)節(jié)點(diǎn)，1227條邊。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示紅芪中的藥物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；網(wǎng)絡(luò)中的邊表示單味藥與活性成分及活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

圖1 紅芪活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Network diagram of active compounds - targets of Radix Hedysari

選取Betweenness Centrality、Degree均大于其平均值的57個(gè)靶標(biāo)作為關(guān)鍵靶標(biāo)，如表2所示。其中，Degree值在前5名的靶點(diǎn)基因分別為AKT1、TP53、IL6、VEGFA及MAPK3，表明這些基因在網(wǎng)絡(luò)中具有重要的位置，可作為紅芪有效成分作用的靶點(diǎn)基因。

表2 紅芪的57個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)Table 2 The 57 key targets of Radix Hedysari

續(xù)表2 紅芪的57個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)Table 2 The 57 key targets of Radix Hedysari

2.3 GO富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO分析，包括生物過程、細(xì)胞組成和分子功能分析，結(jié)果如表3～5所示。GOBP分析顯示有462條生物學(xué)過程與此有關(guān)，最顯著的5條分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)節(jié)，DNA模板、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)及信號(hào)傳導(dǎo)。GOCC分析顯示有48條細(xì)胞組成與此有關(guān)，最顯著的5條分別為細(xì)胞核、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)及質(zhì)膜。GOMF分析顯示有73條分子功能與此有關(guān)，最顯著的5條分別為蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及DNA結(jié)合。結(jié)果表明，紅芪可以通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮其治療作用。

表3 GO-BP分析結(jié)果Table 3 Analysis results of GO-BP

表4 GO-CC分析結(jié)果Table 4 Analysis results of GO-CC

2.4 KEGG通路分析

采用Omicshare數(shù)據(jù)庫(kù)中的高級(jí)氣泡圖技術(shù)對(duì)KEGG進(jìn)行通路分析，其中前20條通路結(jié)果如圖2。富集最顯著的5條通路為癌癥的途徑(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)及腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)。在與疾病類相關(guān)的通路中，主要有乙型肝炎(Hepatitis B)、癌癥的途徑(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、恰加斯病(美國(guó)錐蟲病)(Chagas disease (American trypanosomiasis)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)及利什曼病(Leishmaniasis)等；與信號(hào)傳導(dǎo)功能相關(guān)的有腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信號(hào)通路(Estrogen signaling pathway)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)及催乳素信號(hào)通路(Prolactin signaling pathway)等。

圖2 紅芪作用核心靶點(diǎn)的KEGG富集分析Fig. 2 KEGG enrichment analysis of the core target of Radix Hedysari

2.5 治療疾病的富集分析

在DAVID網(wǎng)站對(duì)紅芪作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行疾病富集分析，有顯著性差異的潛在的治療疾病結(jié)果如表6?？芍?，紅芪具有潛在治療價(jià)值的疾病主要是膀胱癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥，以及慢性阻塞性肺疾病和慢性腎功能衰竭，其中P值最小值所對(duì)應(yīng)的疾病為膀胱癌。

表6 紅芪治療的疾病富集分析Table 6 Enrichment analysis of RadixHedysari in the treatment of diseases

3 討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)，從紅芪藥物中篩選出了14個(gè)活性成分和683個(gè)靶點(diǎn)基因，通過對(duì)這些靶點(diǎn)基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)度值比較高的靶點(diǎn)基因有AKT1、TP53、IL6、VEGFA、MAPK3等。治療疾病的富集分析表明，紅芪具有潛在治療價(jià)值的疾病主要是膀胱癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥。已有研究發(fā)現(xiàn)，AKT1在腫瘤化療的耐藥性方面有著極其重要的作用，AKT1可調(diào)控胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，且經(jīng)常與NF-kappaB、Notch-1、PTEN等共同發(fā)揮作用[16]。TP53基因與腫瘤的關(guān)系極其密切，可通過缺失、突變等直接影響p53蛋白的活性，進(jìn)而導(dǎo)致許多腫瘤的發(fā)生[17]。其中，TP53INP1在肝癌組織和癌旁正常肝組織中都有表達(dá)，但TP53INP1在癌旁正常肝組織中比肝癌組織中表達(dá)更加強(qiáng)烈，可推測(cè)TP53INP1具有一定效果的抑癌作用[18]。IL6的缺失會(huì)加速肝癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生，增加臟器中的腫瘤負(fù)荷，因此可推測(cè)IL6基因能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)[19]。VEGFA(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)率很高，它是VEGF的6個(gè)亞型中最重要的一個(gè)，主要影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化[20]。而肝癌組織中分布著極豐富的血管，因此VEGFA對(duì)肝癌的治療具有良好的作用。VEGFA與miR-206存在直接的靶向關(guān)系，miR-206過表達(dá)靶向VEGFA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移具有明顯的抑制作用[21]；而miR-205也可以借助VEGFA來控制乳腺癌的增殖[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，紅芪作用的潛在通路有癌癥的途徑、膀胱癌、癌癥中的蛋白多糖、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號(hào)通路及HIF-1信號(hào)通路等91個(gè)。其中，癌癥的途徑參與多種活性化合物的抗癌機(jī)制，如PI3K/AKT途徑參與卵巢癌[23]、乳腺癌[24]、非小細(xì)胞肺癌[25]、結(jié)直腸癌[26]等，Wnt途徑參與前列腺癌[27]、結(jié)腸癌[28]、乳腺癌[29]、肝癌[30]等。MAPK signaling pathway與腫瘤惡性演進(jìn)密切相關(guān)，MAPK及其信號(hào)通路在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起到中介和信號(hào)放大作用，能夠接受大量來自生長(zhǎng)因子、絲裂原、環(huán)境刺激等的信號(hào)，還可通過MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達(dá)[31]。如p38 MAPK信號(hào)通路的激活，能夠增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[32]；抑制MAPK信號(hào)通路，能夠克服他莫昔芬耐藥性并改善乳腺癌的預(yù)后；通過抑制MAPK信號(hào)通路能夠抑制BRAF突變型結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇、槲皮素也是紅芪的主要活性成分，而這2個(gè)成分在已有的紅芪相關(guān)研究中并未得到足夠的重視。β-谷甾醇具有較好的抗氧化、抗菌、抗癲癇等作用，并對(duì)胃癌、肝癌、宮頸癌、胰腺癌、肺癌等各種癌細(xì)胞均有較好的抑制作用，其中對(duì)胃癌的作用尤強(qiáng)[34]。槲皮素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，也可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬，而其機(jī)制與抑制TGF-β signaling pathway有關(guān)[35]；能夠抑制人轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)PA-1細(xì)胞系固有凋亡途徑的相關(guān)成分[36]；通過PI3K/AKT通路促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞的死亡，并增強(qiáng)其化學(xué)敏感性[37]；對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的增殖侵襲能力具有抑制作用，并能抑制癌胚抗原(CEA)的表達(dá)[38]；通過抑制VEGF/PI3K/Akt信號(hào)通路，聯(lián)合二甲雙胍能夠協(xié)同抑制前列腺癌細(xì)胞[39]。