李碧嬋，肖國利，黃星星，張 敏

（1.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300；2.福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山 354300）

果膠酶是能降解果膠物質(zhì)的一類酶的總稱[1]。果膠酶在食品、醫(yī)藥、紡織、造紙、動物飼料生產(chǎn)以及廢水處理等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，是生物技術(shù)領(lǐng)域最具商業(yè)價值的酶之一[2]。果膠酶可由微生物或其他生物如植物、線蟲和昆蟲等自然產(chǎn)生[2]。其中，微生物果膠酶以其具有廣泛的底物特異性、誘導(dǎo)性、多功能性以及可作用于多種果膠物質(zhì)的能力，成為許多工業(yè)過程中重要的生物催化劑[3]。據(jù)報道，微生物來源的果膠酶占全球食品和工業(yè)酶銷售額的25%，其市場仍在不斷增長[4]。目前，曲霉屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬和青霉屬已被廣泛應(yīng)用于果膠酶的商業(yè)生產(chǎn)中[1，5]。隨著果膠酶的應(yīng)用越來越廣泛，對其穩(wěn)定性、高活性和特異性的要求也在迅速增加，篩選具有新特性、更高酶活性和大規(guī)模生產(chǎn)果膠酶的微生物的具有重要意義。

內(nèi)生菌通常是指無癥狀地生活在植物組織內(nèi)的細(xì)菌、真菌和放線菌[6]。生活于健康植物組織的內(nèi)生真菌對植物有著深遠(yuǎn)的影響。一方面，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生生物活性化合物，起到化學(xué)防御并促進(jìn)植物生長的作用；另一方面，內(nèi)生真菌還能產(chǎn)生如果膠酶[7-9]、纖維素酶[10-11]、脂肪酶[12]、淀粉酶[13-15]和蛋白酶[16-17]等多種酶類，幫助其侵入并定植于宿主植物組織中。這些真菌酶在生物降解中發(fā)揮重要作用，在洗滌劑和紡織工業(yè)、食品加工、醫(yī)療、制藥以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[18-20]。BEZERR J D P等[21]從仙人掌中分離到兩株具有分解果膠能力的內(nèi)生真菌日本曲霉（Aspergillus japonicus）和產(chǎn)氣櫟生青霉（Penicillium glandicola）。SOPALUN K等[22]從泰國蘭花中發(fā)現(xiàn)有25株內(nèi)生真菌具有果膠酶活性，其中茶擬盤多毛孢（Pseudopestalotiopsis theae）DapR 02具有高產(chǎn)果膠酶的潛力，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，所產(chǎn)果膠酶的酶活達(dá)到1.524 U/mL。

本研究通過十六烷基三甲基溴化胺（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）沉淀法，從蘆葦?shù)闹仓曛蟹蛛x篩選出高產(chǎn)果膠酶的菌株，結(jié)合菌落形態(tài)特征、光學(xué)顯微鏡觀察以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed space，ITS）序列分析對篩選菌株進(jìn)行鑒定，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定其發(fā)酵液的酶活，并對該菌株所產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了分析，為采用該菌株生產(chǎn)果膠酶的后續(xù)研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

蘆葦健康植株采自福建武夷山天心湖邊。

1.1.2 化學(xué)試劑

果膠、D-半乳糖醛酸：上海麥克林生化科技有限公司；十六烷基三甲基溴化胺、3,5-二硝基水楊酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸銨（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

真菌分離培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[9]：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。121 ℃滅菌20 min。

細(xì)菌分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸膏粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15～20 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：果膠2 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO40.5 g，NaNO33 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5。121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：桔皮粉1 g，KH2PO43.8 g，K2HPO4·3H2O 0.2 g，（NH4）2SO42 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-B恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；SUP-080生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；CX23正置生物顯微鏡：奧林巴斯工業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物樣品的預(yù)處理

將新采集的蘆葦植株剪成3～4 cm長，用洗潔精清洗3次，自來水沖洗30 min，紫外燈照射30 min，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，接著用2.5%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3次。

1.3.2 內(nèi)生菌的分離與純化

將植物的外表皮剝離，取根的中間部分，切成0.5 cm×0.5 cm大小，分別插入到真菌分離培養(yǎng)基和細(xì)菌分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)（真菌28 ℃，細(xì)菌37 ℃）。待在植物組織處長出菌落后，及時挑取外觀不同的菌落轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的新鮮分離培養(yǎng)基上，直至純化。

1.3.3 產(chǎn)果膠酶內(nèi)生真菌的篩選

（1）初篩

將1.3.2分離純化得到的內(nèi)生菌接種至果膠酶篩選培養(yǎng)基上，分別在37 ℃或28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。加入10 mL 1%CTAB溶液，靜置5 min后傾去，再加入1%NaCl溶液，靜置5 min。測量透明圈的直徑（Dp）與菌落直徑（Dc）的比值（Dp/Dc），選擇Dp/Dc值較大的菌株進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。

（2）復(fù)篩

將純化后的菌株接種至50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液于8 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，收集上清液，即為粗酶液，用于果膠酶活力測定，根據(jù)粗酶液中果膠酶的活性，確定產(chǎn)酶最優(yōu)的菌株。

1.3.4 果膠酶活性測定

果膠酶活力測定參考張飛等[23]的方法，并稍加改進(jìn)。取1 mL pH 5.0的1%果膠溶液，50 ℃預(yù)熱5 min；加入1 mL預(yù)熱過的適當(dāng)稀釋的粗酶液，立即搖勻，50 ℃水浴保溫30 min，加入2 mL的蒸餾水及2.5 mL的DNS試劑，混勻，于沸水浴中煮沸10 min，流水冷卻后加蒸餾水定容；同時以經(jīng)煮沸滅活的粗酶液作對照，于波長540 nm處測定吸光度值。

果膠酶酶活定義：1 mL酶液在50 ℃、pH 5.0的條件下，1h分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.5 菌種鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的產(chǎn)果膠酶的內(nèi)生真菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)，觀察菌落特征，通過顯微鏡觀察菌株的菌絲、分生孢子囊以及分生孢子的特征。

（2）ITS序列分析

ITS序列分析委托北京信諾金達(dá)生物科技有限公司進(jìn)行。將所測得的序列提交到美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），通過基本局部比對搜索工具（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）與已知的序列進(jìn)行比對分析。

1.3.6 菌株產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)特性研究

（1）酶反應(yīng)的最適溫度

將適當(dāng)稀釋的粗酶液分別在不同溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)時間30 min，測定酶活力，以測得的最高酶活為100%，計(jì)算各溫度條件下的相對酶活，獲得果膠酶的最適反應(yīng)溫度。

（2）酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將稀釋的粗酶液分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃保溫2 h后在最適反應(yīng)條件下測定酶活力，考察果膠酶的溫度穩(wěn)定性。

（3）酶反應(yīng)最適pH值

將稀釋的粗酶液分別在不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)時間30 min，測定酶活力，以測得的最高酶活為100%，計(jì)算不同pH值下的相對酶活，獲得果膠酶的最適反應(yīng)pH值。

（4）酶的pH穩(wěn)定性試驗(yàn)

將粗酶液分別用不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的緩沖液稀釋，在常溫放置24 h，然后在最適反應(yīng)條件下測定酶活力，考察果膠酶的pH穩(wěn)定性。

（5）底物濃度對酶促反應(yīng)的影響

將果膠底物的終質(zhì)量濃度分別調(diào)整為0.40 mg/mL、0.80mg/mL、1.25mg/mL、1.50mg/mL、2.00mg/mL、2.50mg/mL。以DNS法測定酶促反應(yīng)所產(chǎn)生還原糖的量來計(jì)算酶促反應(yīng)初速度，計(jì)算該酶分解果膠的米氏常數(shù)Km和最大酶解速率Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)果膠酶內(nèi)生菌的分離篩選

從蘆葦中共分離得到9株內(nèi)生菌，通過果膠酶篩選培養(yǎng)基平板初篩，獲得4株透明圈明顯的菌株，編號為z1～z4，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)測定果膠酶活力復(fù)篩，結(jié)果見表1。由表1可知，分離篩選獲得一株產(chǎn)果膠酶活力最高的菌株z4，提交至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為：CCTCC M 2019946。菌株z4所產(chǎn)果膠酶活力可達(dá)到40.52 U/mL，遠(yuǎn)高于王齊瑋等[8]從大麻籽中篩選到的產(chǎn)果膠酶的內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵所產(chǎn)生的果膠酶（酶活最高為28.1 U/mL）以及尹樂斌等[24]從臍橙果園土壤中篩選到的尖孢鐮刀菌所產(chǎn)的421 U/L果膠酶酶活，但低于趙曉璐等[9]從荷葉中分離的內(nèi)生真菌炭疽菌屬HY2所產(chǎn)的62.9 U/mL的果膠酶酶活。

表1 產(chǎn)果膠酶菌株的初篩及復(fù)篩Table 1 Primary and secondary screening of pectinase-producing strains

2.2 內(nèi)生菌株z4的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株z4在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征見圖1。由圖1可知，菌落開始為白色絨毛狀，幾天后菌落中央變?yōu)辄S色，之后整個菌落變?yōu)辄S色呈半絨毛狀，繼續(xù)培養(yǎng)，菌落中央及邊沿變?yōu)槟G色，之后整個菌落變?yōu)槟G色。菌株z4在顯微鏡下觀察，可見其孢子囊呈球形或近燒瓶形，分生孢子呈近球形或橢圓形。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果初步鑒定菌株z4為霉菌。

圖1 菌株z4的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Fig.1 Colony morphology and micro-morphological characteristics of strain z4

2.2.2 ITS序列分析

ITS序列分析結(jié)果由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司提供。菌株z4的ITS序列長602 bp（GenBank 登錄號為MW275931）。將z4菌株的ITS序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，所獲得的同源序列均為曲霉屬的ITS序列。將ITS序列與下載的相關(guān)菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株z4基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of strain z4 based on rDNA-ITS sequence analysis

由圖2可知，多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株z4與紅綬曲霉在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支。菌株z4的ITS序列與Aspergillus nomiusKS10（DQ467991.1，GenBank）和Aspergillus nomiusNN20（DQ467990.1，GenBank）的基因序列同源性達(dá)98%。結(jié)合菌落和顯微形態(tài)特征，菌株z4被鑒定為紅綬曲霉（Aspergillus nomius）。

2.3 酶學(xué)特性研究

2.3.1 溫度對果膠酶活性的影響

果膠酶的活性和熱穩(wěn)定性對其在生物技術(shù)過程以及食品工業(yè)中的應(yīng)用至關(guān)重要。研究表明，果膠酶在很寬的溫度范圍內(nèi)（30～80 ℃）都是穩(wěn)定且有活性的[25]。由圖3A可知，由Aspergillus nomiusz4產(chǎn)生的果膠酶在30～70 ℃均有活性，其中，最適反應(yīng)溫度為45 ℃，當(dāng)溫度低于45 ℃時，果膠酶活力隨溫度升高而上升，超過45 ℃酶活力迅速下降，但是在50～70 ℃范圍內(nèi)仍保持50%以上酶活力。由圖3B可知，通過對該酶的熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，在溫度30～40 ℃范圍內(nèi)保溫2 h，其果膠酶活力仍保留80%以上；在20～40 ℃范圍內(nèi)保溫2 h酶活力保留60%；當(dāng)溫度高于50 ℃時，酶活迅速下降，但是在70 ℃條件下保溫2 h，仍具有一定的酶活力。以上結(jié)果說明，該酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃，并且具有較好的溫度穩(wěn)定性。

圖3 溫度對果膠酶活性的影響（A）及熱穩(wěn)定性（B）Fig.3 Effect of temperature on pectinase activity (A) and thermal stability (B)

2.3.2 pH對果膠酶活性的影響

由Aspergillus nomiusz4產(chǎn)生的果膠酶在不同pH下的酶活力變化如圖4A所示，該酶在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)具有活性，在pH 6.0時酶活力最高，低于pH 5.5或高于pH 6.5的條件下酶活均明顯下降，說明該果膠酶在弱酸性條件下顯示出較高的活性。酶的pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖4B所示，該酶在pH 5.0～6.0條件下放置24 h后酶活力保留85%以上，說明在此pH范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定；而在pH4.0以下或pH 7.0以上保存24 h，酶活力迅速下降。

圖4 pH值對酶活力的影響（A）及pH穩(wěn)定性（B）Fig.4 Effect of pH value on pectinase activity (A) and pH stability (B)

2.3.3 酶促反應(yīng)動力學(xué)測定

以果膠濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，制作Lineweaver-Rurk雙倒數(shù)曲線。由圖5可知，Aspergillus nomiusz4所產(chǎn)果膠酶對果膠的水解作用符合米氏方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.016x+0.01（相關(guān)系數(shù)R2=0.991 2），說明曲線擬合良好。由回歸方程計(jì)算得到果膠酶的表觀米氏常數(shù)Km為1.60 mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax為100 mg/（mL·h）。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道相比，Aspergillus nomiusz4所產(chǎn)果膠酶具有更高的底物親和力[5，26]。

圖5 雙倒數(shù)法測定紅綬曲霉z4所產(chǎn)果膠酶的動力學(xué)參數(shù)Fig.5 Kinetic parameters of pectinase from Aspergillus nomius z4 by Lineweaver-Burk determination

3 結(jié)論

本研究采用以果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行平板分離，通過CTAB沉淀法從健康蘆葦植株中篩選出產(chǎn)果膠酶的內(nèi)生真菌，通過搖瓶培養(yǎng)測定各菌株所產(chǎn)果膠酶活力復(fù)篩，選出一株高產(chǎn)果膠酶的菌株z4，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，其果膠酶酶活可達(dá)到40.52 U/mL。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，將z4菌株鑒定為紅綬曲霉（Aspergillus nomius）。該菌株已于2019年11月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM 2019946。該菌株所產(chǎn)果膠酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在30～40 ℃范圍內(nèi)保溫2 h，酶活力保留80%以上，說明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性；該酶的最適作用pH值為6.0，在pH 5.0～6.0條件下放置24 h，酶活力保留85%以上，說明該酶在此pH范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。該酶對果膠具有較高親和力，以果膠為底物時，米氏常數(shù)（Km）值和最大反應(yīng)速率（Vmax值）分別為1.60 mg/mL和100 mg/（mL·h）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘆葦內(nèi)生真菌z4具有良好的果膠酶生產(chǎn)能力，今后可進(jìn)一步研究優(yōu)化其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件以高效地生產(chǎn)果膠酶。