李貽珍，牛珂平，曹瑛瑛，王瑩，文鵬程，喬海軍，張衛(wèi)兵*，張忠明*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(秦王川農(nóng)業(yè)高科技產(chǎn)業(yè)開發(fā)示范基地管理辦公室， 甘肅 蘭州，730030)3(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

凝乳酶(milk-clotting enzymes，MCEs)在干酪生產(chǎn)過程中具有極其重要的作用，它不僅具有凝乳功能，而且能參與干酪成熟過程中的蛋白水解，從而影響干酪的風(fēng)味與品質(zhì)[1]。隨著干酪需求量的不斷增加，傳統(tǒng)小牛皺胃酶的供應(yīng)已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重短缺。因而，傳統(tǒng)小牛皺胃酶的替代品已被廣泛研究，而微生物源凝乳酶是其替代品研究的熱點(diǎn)[2]。許多微生物來源(如霉菌和細(xì)菌)的胞外蛋白酶都具有凝乳功能且性質(zhì)各異，其中米黑霉凝乳酶已被廣泛接受[3-4]。較植物和動(dòng)物來源的凝乳酶，微生物來源的凝乳酶具有凝乳活力高、性能多樣化、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、便于基因改造等優(yōu)點(diǎn)[2]。相對(duì)于真菌的固態(tài)發(fā)酵，細(xì)菌深層發(fā)酵產(chǎn)酶更容易自動(dòng)化控制[5]。目前干酪市場(chǎng)需求量的增大不斷推進(jìn)小牛皺胃酶替代品的研發(fā)，許多微生物凝乳酶雖然不能直接替代小牛皺胃酶，但是可以作為小牛皺胃酶的輔劑或干酪催熟劑，甚至有些可以用于開發(fā)新型乳制品[6]。AN等[1]用解淀粉芽孢桿菌中提取的微生物凝乳酶和小牛皺胃酶制作切達(dá)干酪并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者成分差別不大。YANG等[7]利用枯草芽孢桿菌提取凝乳酶并運(yùn)用于青藏高原所產(chǎn)的牦牛乳中，發(fā)現(xiàn)其在牦牛乳品工業(yè)中具有一定的潛力。

在凝乳過程中，影響凝乳的因素有很多，包括凝乳溫度、凝乳pH、鈣離子濃度、酶添加量等[8]。不同來源的凝乳酶對(duì)溫度的要求不同[9]，RAJESH等[10]報(bào)道的BacillussubtilisMTCC 10422凝乳酶最適溫度為45 ℃；AHMED等[11]發(fā)現(xiàn)Bacilluslicheniformis5A5凝乳酶在75 ℃ 條件下活性最高。溫度對(duì)凝乳酶特性的影響極為重要，例如通過影響粒子碰撞頻率，從而影響凝乳速率。溫度過低會(huì)導(dǎo)致膠束穩(wěn)定性增加，妨礙膠束的聚集，溫度過高又會(huì)導(dǎo)致凝乳酶失活[12]。此外，溫度會(huì)影響凝乳活性、乳清的排出、凝塊的硬度、奶酪的出品率等[13]。

本研究利用地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶，探究不同溫度條件下凝乳過程中的濁度、黏度、乳清OD值、持水力、流變學(xué)特性以及微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，并與商品酶作比較，為后期凝乳酶在奶酪中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮荷斯坦牛乳，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)；地衣芽孢桿菌 D3.11，由本實(shí)驗(yàn)室分離純化并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號(hào)為 CGMCC 3289)；麩皮，淮南鴻汶農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；商品凝乳酶(由70%皺胃酶和30%牛胃蛋白酶組成，活力為100 000 U/g)，深圳富晟生物科技有限公司；纖維素透析袋(12 000～14 000 Da)，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

尼羅紅(超級(jí)純)，梯希愛(上海)化城工業(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇(分析純)，甘肅易飛儀器科技有限公司。其他試驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，瓊脂15，pH 7.2～7.4。

麩皮培養(yǎng)基:麩皮18 g，水100 mL，煮沸10 min，然后用4層紗布過濾，將濾液補(bǔ)水至100 mL，121 ℃滅菌25 min，pH值自然。

液體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，pH 7.2～7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

754 PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；LVDV-1型數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，上海方瑞儀器有限公司；LSM 800型激光掃描共聚焦顯微鏡，卡爾·蔡司股份公司；Discovery HR-1型混合流變儀，美國TA Instruments公司；真空冷凍干燥機(jī)，Scientz-ND寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 菌株發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1 菌種活化

將實(shí)驗(yàn)室斜面保藏的Bacilluslicheniformis菌種轉(zhuǎn)接至斜面種子培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，接入液體培養(yǎng)基，37 ℃、175 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2 粗酶液的發(fā)酵

將活化后的液體種子以4%的接種量接入麩皮發(fā)酵基中，37 ℃搖床(轉(zhuǎn)速175 r/min)培養(yǎng)72 h，8 000 r/min離心10 min后得到粗酶液。

1.3.3 地衣芽孢桿菌凝乳酶的制備

向粗酶液中邊緩慢攪拌邊加硫酸銨細(xì)粉末，磁力攪拌2 h，使硫酸銨充分溶解，飽和度達(dá)到20%。4 ℃離心15 min，收集上清液，緩慢加入硫酸銨至飽和度達(dá)到75%；4 ℃冰箱中靜置過夜，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于0.05 mol/L，pH為6.2 的磷酸緩沖液中，置于透析袋中，在4 ℃條件下透析20 h。將透析后的酶液，倒入鋁盒置于真空冷凍干燥機(jī)凍干23 h，收集酶粉，-20 ℃保存。

1.3.4 酶液的配制

稱取一定量的酶粉，溶解于磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.2)中，將其酶活力調(diào)整為155 Su/mL，不同溫度條件下預(yù)熱5 min備用。

1.3.5 脫脂乳的制備

新鮮荷斯坦牛乳4 000 r/min離心35 min去除上層脂肪，加0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))疊氮鈉備用。

1.4 不同溫度對(duì)凝乳酶的影響

1.4.1 黏度的測(cè)定

參照孔學(xué)民等[14]的方法。將脫脂乳分別水浴預(yù)熱至25、30、35、40、45、50 ℃，取不同溫度下乳樣50 mL，加入酶液，充分混勻，每隔10 min測(cè)定體系黏度值。

1.4.2 濁度的測(cè)定

參照MIZUNO等[15]的方法。將脫脂乳分別水浴預(yù)熱至25、30、35、40、45、50 ℃，取不同溫度下乳樣各5 mL，加入酶液，充分混勻，每隔5 min取適量樣品稀釋，紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定體系在450 nm處的透光率(T)，以(100-T)%代表濁度。

1.4.3 流變學(xué)特性的測(cè)定

參照ZHANG等[16]的方法，略作修改。分別取不同溫度條件下乳樣4 mL，加0.4 mL酶液，混勻30 s后立即轉(zhuǎn)移到流變儀玻耳帖平板上，進(jìn)行時(shí)間掃描。測(cè)試溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃，測(cè)試探頭為60 mm平行板，間隙1 000 μm，頻率1 Hz，應(yīng)力0.1 Pa，采點(diǎn)間隔5 s，測(cè)定時(shí)長60 min。所有測(cè)試均在線性黏彈性區(qū)域內(nèi)，測(cè)定參數(shù)是儲(chǔ)能模量(G′)。

1.4.4 持水力的測(cè)定

參照GB 5009.239—2016[3]的方法。取5 mL脫脂乳置于10 mL離心管中，分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下凝乳30 min， 4 ℃、7 000 r/min離心10 min，取上清液稱重，代入公式(1)得到乳樣持水力：

(1)

1.4.5 乳清OD值的測(cè)定

參照李偉等[17]的方法。取待測(cè)乳樣5 mL置于10 mL離心管中，分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下凝乳30 min， 4 ℃、7 000 r/min離心10 min，取上層排出的乳清，721紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定乳清在500 nm處的吸光值。

1.4.6 凝塊微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考LOPEZ等[18]的方法。在脫脂乳中分別添加2種酶，凝乳60 min，使用不銹鋼刀片從凝乳樣品切取4 mm×5 mm×2 mm的薄片，置于帶槽載玻片上，滴加2滴尼羅紅乙醇溶液(0.1 g/L)于暗室中染色6 min；染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗染料，然后蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝乳過程中黏度的變化

圖1為不同溫度條件下，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶和商品酶在凝乳過程中的黏度變化情況。由圖1可以看出，在25、30、35、40 ℃條件下，2種酶凝乳過程中黏度均先增大，而后保持穩(wěn)定。當(dāng)凝乳溫度為25 ℃時(shí)，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度在30 min時(shí)達(dá)到最大值3 343 mPa·s，商品酶體系的黏度值也在30 min時(shí)達(dá)到最大值3 351 mPa·s；當(dāng)凝乳溫度為30 ℃時(shí)，2種酶作用的體系黏度值均穩(wěn)定上升，在30 min時(shí)達(dá)到最大值，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的最大值為3 143 mPa·s，商品酶體系的最大值為3 201 mPa·s；35 ℃條件下，10 min時(shí)2種體系的黏度值達(dá)到峰值，此時(shí)，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值為3 396 mPa·s，商品酶體系的黏度值為3 349 mPa·s；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，凝乳10 min后2種酶體系的黏度值達(dá)到峰值并保持穩(wěn)定，此時(shí)地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值為3 380 mPa·s，商品酶體系的黏度值為3 371 mPa·s，這表明在40 ℃條件下，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶與商品酶的凝乳效果差異不大；在45 ℃條件下，凝乳10 min時(shí)商品酶體系黏度達(dá)到最大值3 379 mPa·s，地衣芽孢桿菌體系凝乳酶黏度值為3 330 mPa·s，凝乳40 min后2種酶體系黏度值均下降，且商品酶體系比地衣芽孢桿菌體系下降的更快；當(dāng)凝乳溫度為50 ℃時(shí)，商品酶體系的黏度值普遍低于地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值，且達(dá)到峰值后，商品酶體系的黏度值下降速度更快。綜上，隨著凝乳溫度的升高，蛋白質(zhì)之間的相互作用不斷增強(qiáng)，酪蛋白膠束間距離的縮小以及蛋白分子聚集體體積的增大，最終導(dǎo)致體系黏度的增加，且隨著凝乳時(shí)間的延長，酶凝膠形成的同時(shí)，乳清不斷析出，導(dǎo)致在測(cè)定時(shí)黏度值達(dá)到最大后下降，這與ZHAO等[19]的研究結(jié)果保持一致。

a-25 ℃；b-30 ℃；c-35 ℃；d-40 ℃；e-45 ℃；f-50 ℃；圖1 不同溫度條件下凝乳過程中黏度的變化Fig.1 Change of viscosity during the skimmed milk coagulation process under different temperature 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 凝乳過程中濁度的變化

濁度值表示酪蛋白膠束的聚集程度[20]，濁度值越大，酪蛋白膠束聚集程度越大，膠體溶液對(duì)光透過率越低[15]。由圖2可知，30、35、40、45 ℃條件下，隨著凝乳溫度的上升，添加地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶與商品酶的2種反應(yīng)體系的濁度逐漸增大。當(dāng)凝乳溫度為25、30、35、40、45、50 ℃時(shí)，前10 min內(nèi)商品酶體系濁度增長率分別為54.58%、46.17%、25.15%、22.54%、22.12%、14.72%；地衣芽孢桿菌凝乳酶體系濁度增長率分別為37.54%、32.35%、35.16%、28.45%、17.82%、10.96%。這表明，凝乳溫度越高，2種酶體系的濁度增長率越低，且商品酶體系的增長率大于地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的增長率。在25 ℃條件下，凝乳15 min后濁度值顯著降低(P<0.05)，可能是因?yàn)闇囟容^低，凝乳酶活力較低，酪蛋白膠束聚集松散不穩(wěn)定[20]；在50 ℃條件下，凝乳10 min后濁度值顯著降低(P<0.05)，這是由于凝乳溫度高于適宜溫度導(dǎo)致凝乳酶活力下降，說明溫度過高會(huì)降低凝乳效果。綜上所述，凝乳過程中，凝乳酶對(duì)溫度比較敏感，適宜的凝乳溫度對(duì)凝乳體系濁度的變化極為關(guān)鍵[21]。

a-25 ℃；b-30 ℃；c-35 ℃；d-40 ℃；e-45 ℃；f-50 ℃圖2 不同溫度條件下濁度的變化Fig.2 Change of Turbidity under different temperature

2.3 凝乳過程中的流變學(xué)特性

G′，又稱彈性模量，指在振動(dòng)條件下每個(gè)應(yīng)變周期所儲(chǔ)存的能量大小，代表凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。凝乳過程中G′的減小表示凝乳結(jié)構(gòu)中鍵合強(qiáng)度與數(shù)目減少，酪蛋白之間的融合作用會(huì)導(dǎo)致凝乳結(jié)構(gòu)在剪切作用下遭到破壞[22]。

圖3為商品酶和地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶凝乳體系的G′變化情況。當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，2種酶體系的G′均隨時(shí)間的延長逐漸上升，這是由于低溫度下凝乳酶活力較低，酶解κ-酪蛋白速率較慢，導(dǎo)致G′變化緩慢[21]；當(dāng)溫度>25 ℃時(shí)，不同溫度條件下2種凝乳酶體系的G′均隨時(shí)間的延長先上升，達(dá)到最大值后下降；在30、35、40、45、50 ℃條件下，商品酶體系G′的峰值分別為116.81、269.01、191.09、109.11、55.06 Pa，到達(dá)峰值的時(shí)間分別是2 760、2 710、1 438、967、594 s；地衣芽孢桿菌凝乳酶體系G′的峰值分別為145.06、232.91、187.03、142.06、42.35 Pa，到達(dá)峰值的時(shí)間分別是1 981、1 103、832、649、568 s。這說明，隨著凝乳溫度的上升，凝乳時(shí)間提前，2種酶體系的最大G′不斷下降，其中，地衣芽孢桿菌體系比商品酶體系的凝乳時(shí)間分別提前了779、1 607、606、318、26 s。當(dāng)溫度>40 ℃后，2種酶體系的G′下降迅速，這是由于隨著時(shí)間的延長，凝乳酶活力下降，且過高的溫度還會(huì)導(dǎo)致添加凝乳酶后立即凝乳，使凝乳酶混合不均勻，影響凝乳效果，與黃東旭等[23]的研究結(jié)果基本一致。

a-商品酶體系；b-地衣芽孢桿菌凝乳酶體系圖3 不同溫度條件下儲(chǔ)能模量G′的變化Fig.3 Change of storage modulus inenzyme coagulation process under different temperature

2.4 持水力變化

持水力越大，說明體系中束縛水含量越多[24]。由圖4可知，2種酶作用下，體系持水力均隨溫度的上升呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)凝乳溫度為25、30、35 ℃時(shí)，商品酶體系的持水力為87.82%、94.00%、97.33%，地衣芽孢桿菌體系的持水力為87.64%、91.70%、93.34%，2種酶體系的持水力均顯著上升(P<0.05)；當(dāng)凝乳溫度為40、45、50 ℃時(shí)，商品酶體系的持水力為91.64%、90.48%、88.06%，地衣芽孢桿菌體系的持水力為92.33%、90.85%、90.36%，2種酶體系的持水力均顯著下降(P<0.05)，由此得出，當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，2種酶體系的持水力隨溫度升高逐漸減小，這可能是溫度超過了凝乳酶的最適作用溫度，蛋白質(zhì)膠束的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，水合作用降低，形成的凝塊收縮脫水，與孫金威等[25]的研究結(jié)果基本一致。

圖4 不同溫度條件下持水力的變化Fig.4 Change of water-holding capacity under different temperature

2.5 乳清OD值的變化

乳清OD值是凝乳過程中排出乳清的吸光值，乳清OD值越小，表示乳清中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低。由圖5可知，在25、30、35、40、45、50 ℃條件下，商品酶體系的乳清OD值分別為0.224、0.281、0.340、0.348、0.413、0.422，說明商品酶體系的乳清OD值隨溫度升高顯著增大(P<0.05)；地衣芽孢桿菌酶體系的乳清OD值分別為0.231、0.360、0.372、0.384、0.462、0.479，說明地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的乳清OD值隨溫度升高顯著增大(P<0.05)。在不同溫度條件下，地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的乳清OD值均大于商品酶體系。據(jù)雒亞洲等[26]研究表明，隨著溫度的升高，凝塊收縮的速度加快并伴有乳清析出。當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，乳清OD值迅速增大，這是由于溫度過高使凝乳酶失活嚴(yán)重，與AMARO-HERNANDEZ等[27]的研究結(jié)果一致。

圖5 不同溫度條件下乳清OD值的變化Fig.5 Change of whey OD value under different temperature

2.6 溫度對(duì)凝乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6為激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)的不同溫度下凝乳的微觀結(jié)構(gòu)。由圖6可知，在30 ℃條件下形成的2組凝塊蛋白微粒聚集緊密，孔隙較小；40 ℃條件下，2組凝塊蛋白微粒聚集的更加明顯，蛋白微粒間交叉連接更多，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔隙更?。?0 ℃條件下，孔隙明顯比其他溫度下的樣品更多、更大，說明蛋白微粒間的相互作用加強(qiáng)，結(jié)構(gòu)呈緊縮狀態(tài)。這是由于蛋白微粒間的相互作用強(qiáng)烈依賴于溫度[28]，高溫下，疏水相互作用增強(qiáng)導(dǎo)致蛋白微粒收縮[29]，與范金波等[30]的研究結(jié)果基本一致。在30和40 ℃條件下，商品酶組比地衣芽孢桿菌凝乳酶組蛋白微粒聚集的更緊密，孔隙更?。欢?dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，商品酶組的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比地衣芽孢桿菌組的孔隙大，結(jié)構(gòu)更疏松。

a、d-30℃地衣芽孢桿菌凝乳酶、商品酶凝乳的微觀結(jié)構(gòu)； b、e-40℃地衣芽孢桿菌凝乳酶、商品酶凝乳的微觀結(jié)構(gòu)； c、f-50℃地衣芽孢桿菌凝乳酶、商品酶凝乳的微觀結(jié)構(gòu) 圖6 不同溫度下凝乳的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of curds at different temperatures 注：圖中紅色部分為被尼羅紅染色的乳蛋白，黑色部分即孔隙為水相

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在不同溫度條件下，比較分析了地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶與商品酶的凝乳性能情況。結(jié)果表明，在凝乳過程中，隨著凝乳溫度的升高，蛋白質(zhì)之間的相互作用不斷增強(qiáng)，2種酶體系的黏度值逐漸增大，溫度較高時(shí)，長時(shí)間凝乳會(huì)導(dǎo)致體系黏度值下降；在30～45 ℃時(shí)2種酶體系的濁度隨溫度升高顯著增大(P<0.05)；在35和40 ℃條件下，OD值相近且不顯著(P>0.05)；流變學(xué)特性表明，隨著凝乳溫度的上升，2種酶體系的最大G′不斷下降，且商品酶體系比地衣芽孢桿菌體系的G′下降快；在35 ℃時(shí)2種酶體系的持水力均達(dá)到最大；2種酶體系的乳清OD值均隨溫度的升高而顯著增大(P<0.05)；微觀結(jié)構(gòu)表明在40 ℃條件下，2種酶的凝乳效果最好，且商品酶組比地衣芽孢桿菌凝乳酶組蛋白微粒聚集的更緊密，孔隙更小。綜上所述，凝乳溫度在凝乳過程中，具有極其重要的作用，結(jié)合相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定情況可知，在實(shí)際的應(yīng)用過程中，確定其最適溫度需結(jié)合多個(gè)角度的考量，可以考慮按一定比例將2種凝乳酶復(fù)配使用，以達(dá)到最佳的凝乳性能。