薛霞，趙慧男，魏莉莉，丁一，宿書芳，盧蘭香，王駿，劉艷明*，胡梅

1(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南， 250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南， 250101)

蜂蜜作為一種營養(yǎng)豐富的天然保健品，深受廣大消費者青睞。蜂蜜除了果糖、葡萄糖外，還含有各種維生素、礦物質、氨基酸、多酚類、黃酮類、多糖、活性酶和類胡蘿卜素等活性物質，因此，蜂蜜具有抗氧化、抗菌、促進心腦和血管功能等生理功能[1-2]，常服用蜂蜜對心臟病、高血壓等疾病都有良好的輔助醫(yī)療作用。水溶性維生素是人體維持正常生理功能所必須的一類微量有機物質，適量攝取對生長、代謝、發(fā)育都起到了積極的促進作用。水溶性維生素檢測方法主要包括微生物方法[3-4]、液相色譜法[5-12]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[13-17]。微生物法靈敏度高但步驟繁瑣、檢驗周期長。液相色譜法前處理相對簡單，但多種維生素同時檢測存在一定困難，主要因為紫外檢測器選擇性較差，易受基質干擾；部分化合物沒有生色基團，紫外檢測器靈敏度較低，經(jīng)常需要衍生化操作，衍生條件限制了多種化合物的同時檢測。液相色譜-串聯(lián)質譜法具有高靈敏度、高精確度、高通量的特點，已廣泛應用于多種食品基質中水溶性維生素的測定。

對水溶性維生素檢測的報道大多集中在飲料[5,11-13]、保健品[6]、嬰幼兒配方食品[14-16]、特殊醫(yī)學配方食品[17]等基質，對于蜂蜜中多種水溶性維生素含量測定的研究較少[7,18-20]。因維生素化學結構及性質差異大，已報道的文獻方法大多未采取凈化措施。液相色譜-串聯(lián)質譜法在選擇性和靈敏度方面優(yōu)勢明顯，但基于其檢測原理，基質效應(matrix effect,ME)很容易影響定量結果的準確性。同位素內(nèi)標是解決基質影響最好的辦法，但內(nèi)標價格昂貴，且未完全普及。為有效解決ME對蜂蜜中多種維生素定量結果的影響，本文建立了以甲酸銨溶液作為提取溶劑，HLB固相萃取柱進行凈化的前處理方法。該過程有效去除了蜂蜜中糖分、氨基酸等物質對目標物的影響，實現(xiàn)了蜂蜜中5種水溶性維生素的準確定量分析。

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀建立了蜂蜜中維生素B1、維生素B2(核黃素)、吡哆醇、泛酸維生素B5)和生物素(維生素B7)的分析方法。該方法前處理過程簡單，回收率和精密度滿足方法確認要求。除生物素靈敏度與國家標準[4]相當外，其他化合物的靈敏度比現(xiàn)有國家標準[8-10]高10～20倍。蜂蜜中維生素是其天然品質的體現(xiàn)，屬于微量營養(yǎng)成分，其含量的檢測對方法的靈敏度要求較高。本研究建立的方法既能提供較高的靈敏度，又能實現(xiàn)多種維生素同時檢測，非常適用于蜂蜜中多種水溶性維生素含量的同時測定。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30AD-8050超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(配有電噴霧電離源)，日本Shimadzu公司；3-18K臺式高速離心機，德國Sigma公司；MS303S電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；MS3型旋渦混合器，德國IKA公司；SB-800DTD超聲清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 樣品處理

樣品提?。簻蚀_稱取2.5 g試樣(精確至0.001 g)于25 mL比色管中，加入20 mL提取液渦旋混勻至蜂蜜完全溶解，冰水浴超聲15 min，取出后恢復至室溫，用提取液定容至刻度，搖勻，得到試樣溶液。若樣品中有少量花粉，可用濾紙過濾，收集濾液待用。

樣品凈化：依次用5 mL甲醇，5 mL水活化HLB固相萃取柱。移取1 mL上清液，以不高于1.0 mL/min的流速全部通過固相萃取柱，棄去流出液；用1 mL提取液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干；用1 mL甲醇洗脫并收集全部洗脫液。40 ℃氮吹至近干，初始流動相定容至1 mL，渦旋混勻后，經(jīng)微孔濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析測定。試驗過程應在避光環(huán)境下進行。

1.3 LC-MS/MS條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，或性能相當者；流動相：A為20 mmol/L甲酸銨溶液，B為甲醇，洗脫梯度見表1；流速：0.35 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for UPLC separation

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI源)；檢測方式：多反應監(jiān)測(multiple reation monitoring,MRM)；掃描方式：正離子模式掃描；霧化氣流量：3 L/min；加熱氣流量：10 L/min；接口溫度：300 ℃；DL管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；干燥氣流量：10 L/min。

5種維生素的定量離子對、定性離子對、駐留時間、Q1 Pre 偏差、Q3 Pre 偏差見表2。

拋填片石、黏土比例一般按1：1，片石強度要求≥30MPa，尺寸約15～25cm。黏土需具有較好的黏性，一般采用將黏土潤濕捏成黏土球，直徑約10～15cm，或者采用拋填袋裝黏土方式，效果強于將黏土散投入孔。對于埋深較深或洞高較大的溶洞，為加強填充圓臺的穩(wěn)固性能，可摻入適當PO32.5級水泥，水泥用量占黏土的1/3左右，水泥采用袋裝拋填方式較好。也可采用在拋填片石黏土中摻入稻草、麻繩的方式，稻草、麻繩能起到加筋效果，能有效提高片石、黏土圓臺的穩(wěn)固性能。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

這5種維生素化學結構中均含有伯胺、仲胺基團或含氮雜環(huán)結構，易被電離成正離子。本實驗采用電噴霧離子源，在正離子掃描模式下對化合物進行母離子掃描，獲得化合物的準分子離子峰；在產(chǎn)物離子掃描模式下，以各個化合物的準分子離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，獲得碎片離子信息，選擇豐度較強，基質干擾較小的兩對離子為為定性定量離子；在MRM模式下，優(yōu)化碰撞能等質譜參數(shù)，優(yōu)化后的質譜條件見表2。

表2 五種維生素質譜檢測條件Table 2 MS/MS parameters of 5 kinds of vitamins

維生素B1、吡哆醇和泛酸極性較強，在常規(guī)C18柱上保留較弱。本實驗選擇了Waters HSS T3色譜柱進行分離，該色譜柱對極性化合物保留較強。流動相組成能夠影響目標化合物的分離、峰形和離子化效率，在相同的梯度洗脫條件下，分別考察甲醇-0.1%甲酸、甲醇-甲酸銨、甲醇-甲酸銨(含0.1 %甲酸)、乙腈-甲酸銨等4種流動相在HSS T3 色譜柱上對目標化合物分離情況、靈敏度、峰形的影響。結果發(fā)現(xiàn)甲酸和酸化甲酸銨做流動相時，維生素B1保留時間在1 min左右，峰形拖尾；泛酸在酸性條件下色譜保留更好但響應值低。甲酸銨做流動相時各化合物保留時間適中，峰形對稱，且響應值均比甲酸條件下更高。當有機相為乙腈時，保留時間稍短，目標物峰形和響應值變化不大。綜上，本研究選擇甲醇-甲酸銨體系進行色譜分離。

研究還考察了10、20和50 mmol/L這3個濃度水平的甲酸銨做流動相時對目標物的影響。發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度增加，泛酸保留時間逐漸由2.31 min增加至2.49 min，響應值也明顯增加，維生素B1、維生素B2、吡哆醇和生物素受鹽濃度影響很小。鹽濃度越高在色譜系統(tǒng)析出的風險越大，流動相中鹽濃度的增加也會增加質譜離子源部分的霧化難度。在20 mmol/L條件下，泛酸響應值已很好，完全滿足蜂蜜的檢測需求，因此，最終選擇甲醇-20 mmol/L甲酸銨為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，使目標物與雜質組分有效地分離，峰形良好，混合標準溶液的譜圖見圖1。

A-維生素B1；B-維生素B2;C-泛酸；D-吡哆醇；E-生物素圖1 五種維生素標準溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 5 kinds of vitamins standard solution

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

5種待測目標物均易溶于水，在酸性或中性溶液中穩(wěn)定性較好。蜂蜜中大量的糖分、氨基酸、礦物質等也易溶于水，水系溶劑能使樣品均勻分散，更有利于目標物的提取，為此本實驗選擇不同pH值的水溶液作為提取溶劑。分別考察了0.1 mol/L鹽酸溶液(提取液1)、0.1%甲酸溶液(提取液2)、pH值4.5的甲酸-甲酸銨溶液(提取液3)、20 mmol/L甲酸銨溶液(提取液4)和純水(提取液5)5種提取溶劑的提取效率，結果如圖2所示。低pH值條件下，維生素B1和吡哆醇均呈離子化狀態(tài)，影響了其在固相萃取柱(solid phase extraction,SPE)SPE柱上的保留，回收率明顯偏低；pH低于4.5時生物素回收率較低，甲酸銨和水作為提取劑時生物素回收率無區(qū)別。因蜂蜜中含有多種有機酸，用純水做為提取溶劑時，蜂蜜的提取溶液呈酸性，維生素B1回收率較低。維生素B2維生素在提取劑2中，基質增強回收偏高，在剩余4種提取溶劑中回收率都很好。綜上，本實驗選擇20 mmol/L甲酸銨溶液作為提取溶劑。

圖2 不同提取劑對5種維生素回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recoveries of five vitamins

2.2.2 固相萃取柱的選擇

蜂蜜中含有大量的果糖和葡萄糖，如果不進行凈化，很容易在離子源中碳化，出現(xiàn)離子傳輸管堵塞等問題，影響目標物的離子化過程，降低其離子化效率，從而影響分析結果的準確性。SPE柱因具有簡單、快速、高效等特點被廣泛應用于多種食品基質中目標物凈化和富集。本實驗考察了Waters Oasis HLB(200 mg,6 mL)、PRiME HLB(200 mg,6 mL)和C18(500 mg,6 mL)這3種固相萃取柱對5種維生素回收率的影響(見圖3)。結果表明維生素B1和泛酸在PRiME HLB的上樣和淋洗過程中損失太多，回收率偏低，不能滿足檢測需求。維生素B1和生物素在C18上回收率不足80%，泛酸和吡哆醇在HLB和C18回收率接近，維生素B2用C18凈化后回收率偏高，經(jīng)確認是基質增強明顯造成的。HLB固相萃取柱是在聚合物上鍵和官能團，在去除糖類、蛋白等雜質上有一定的優(yōu)勢，5種化合物均能得到很好地保留，回收率在85%以上，而C18柱是硅膠基體，不耐干涸，凈化過程需要更嚴格的控制，綜合考慮，本研究選擇HLB柱作為凈化柱。

圖3 不同固相萃取柱對5種維生素回收率的影響Fig.3 Effect of different solid phase extraction columns on recoveries of five vitamins

研究還對60、200和500 mg這3種規(guī)格型號的HLB柱對目標物的回收率影響進行了考察。結果發(fā)現(xiàn)60 mg填料太少，對目標物保留弱，在上樣和淋洗過程中維生素B1、泛酸均有較大程度損失，維生素B1的回收率為36.7%，泛酸的回收率不足5%；200 mg和500 mg的2種填料的回收率幾乎無差異，基于經(jīng)濟考慮，本研究最終選擇Waters Oasis HLB(200 mg，6 mL)作為凈化柱。

2.2.3 上樣體積和洗脫液體積的優(yōu)化

確定固相萃取柱后，經(jīng)進一步比較、優(yōu)化了上樣體積和洗脫用甲醇的體積對回收率和ME的影響。實驗選取了0.5、1和2 mL這3個上樣體積進行比較。結果發(fā)現(xiàn)上樣體積為2 mL時，泛酸ME明顯增強，上樣體積對其他目標物影響不大，為保證目標物的靈敏度，選擇上樣體積為1 mL。在上樣體積為1 mL 的條件下，分別采用0.5、1和2 mL甲醇對5種目標物進行洗脫，結果發(fā)現(xiàn)，當甲醇含量為0.5 mL時目標物回收率均低于50%；當洗脫體積為1 mL和2 mL時，5種目標物回收率無差異，洗脫液體積增加會延長氮吹時間，同時還可能將更多的雜質一起洗脫下來，因此最終選擇1 mL甲醇進行洗脫。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限

將混合標準工作溶液注入超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定，獲得標準溶液的質量色譜圖。以定量離子的峰面積(y)對其質量濃度(x)作標準曲線，得到線性回歸方程。分別向蜂蜜樣品中加入10、20、50和100 μg/kg的標準物質，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限為20 μg/kg，以信噪比S/N≥10確定方法的定量限為50 μg/kg。5種水溶性維生素的線性范圍、回歸方程、線性相關系數(shù)、方法檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification，LOQ)見表3。在質量濃度5～200 ng/mL范圍內(nèi)，定量離子的峰面積與質量濃度之間呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.99。洋槐蜜中5種維生素定量限水平的多反應監(jiān)測色譜圖如圖4所示。

表3 五種維生素的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、 檢出限及定量限Table 3 Linear ranges, the linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of five vitamins

2.3.2 回收率與精密度

選擇5種維生素含量都較低的洋槐蜜作為空白樣品，向此樣品中添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液，每個水平做6個平行實驗，測定5種維生素的回收率，考察方法的回收率和精密度(表4)。由表4可知，蜂蜜中5種維生素的加標回收率在90.2%～108.8%，相對標準偏差為1.49%～10.93%，方法的回收率和精密度滿足微量分析的要求。

表4 五種維生素的回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations of five vitamins in acacia honey(n=6)

2.4 基質效應

液相色譜-串聯(lián)質譜檢測過程中一般都存在一定的基質效應ME，常需要通過ME來評價方法的靈敏度和選擇性。取空白蜂蜜基質樣品，按1.2的步驟制備空白基質溶液。分別用基質溶液和定容溶劑稀釋標準儲備液，得到同濃度水平的測定液。分別測定上述2種溶液中目標成分的響應值，計算兩者的相對比值來評價ME，如公式(1)所示：

(1)

ME絕對值越大基質效應越強。

蜂蜜中5種維生素的基質效應見圖5，結果表明，吡哆醇基本無基質效應，維生素B1、維生素B2、泛酸和生物素的ME的絕對值小于10%，滿足定量需求。因此，本方法采用純?nèi)軇藴是€定量，減少了匹配相同空白基質的難操作性及不同空白樣匹配帶來的差異性。

A-維生素B1；B-維生素B2;C-泛酸；D-吡哆醇；E-生物素圖4 洋槐蜜中5種維生素定量限水平的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram showing the LOQs for five vitamins spiked in acacia honey

圖5 蜂蜜中5種維生素基質效應評價圖Fig.5 Matrix effects in UPLC-MS/MS analysis of five vitamins in honey

2.5 實際樣品測定

采用本研究建立的分析方法對蜂場采集的15批次蜂蜜樣品和網(wǎng)絡采購的15批次蜂蜜樣品進行分析。結果表明，30批次蜂蜜中維生素B1和生物素含量均低于定量限；維生素B2檢出率為10%，含量分別為74.6、80.7和315.8 μg/kg；2個網(wǎng)購的蜂蜜樣品中泛酸檢測值在檢出限和定量限之間，剩余28個樣品含量范圍是70.7～1 774.3 μg/kg；9個蜂蜜樣品中吡哆醇低于定量限，21個樣品蜂蜜中吡哆醇的含量范圍是58.3～658.4 μg/kg。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中5種水溶性維生素的分析方法。該方法以甲酸銨溶液作為提取溶劑，HLB固相萃取柱對目標物進行凈化，可明顯減少基質影響；以HSS T3色譜柱進行目標物的分離，目標物保留適中，峰形對稱；方法的回收率、精密度和靈敏度均能滿足各類檢測要求，可應用于蜂蜜中5種水溶性維生素的同時檢測，大幅提高了檢測效率。