姚周麟 吳韶輝 應(yīng)晶琪 王達(dá)萍 林 媚

（浙江省柑橘研究所 318026）

磷元素是農(nóng)作物的生長和發(fā)育過程中必需的大量營養(yǎng)元素之一。橘園土壤有效磷是土壤養(yǎng)分的一個(gè)重要指標(biāo)及磷肥施用量的參考指標(biāo)，其可用于更好地指導(dǎo)柑橘果園的生產(chǎn)管理。目前土壤有效磷測定方法有全波長酶標(biāo)儀法[1]，吸收光譜測量法[2]，高光譜法[3]，Olsen法[4]等。本實(shí)驗(yàn)室主要采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T1121.7-2014）吸收光譜法，該法中將土壤分為酸性土壤（pH＜ 6.5）和中性、堿性土壤（pH≥ 6.5）并采用不同試劑進(jìn)行提取。柑橘園土壤pH分級標(biāo)準(zhǔn)為pH＜ 4.5（強(qiáng)酸性），4.5～ 5.5（酸性）， 5.5～ 6.5（弱酸性）， 6.5～7.5（弱酸至弱堿性），＞ 7.5（堿性） 5 級。其中pH 4.5～ 5.5和 6.5～ 7.5基本適宜柑橘生長，pH 5.5～ 6.5的弱酸性土較適宜柑橘生長[5]。研究表明，大多數(shù)的柑橘產(chǎn)區(qū)土壤為偏酸性，如云南玉溪[5]、湖北夷陵區(qū)[6]、湖北丹江口市[7]、三峽庫區(qū)[8]、重慶市[9]、廣西[10]等[11]，適用此法來進(jìn)行測定。

在對酸性土壤有效磷的測定中，需要用到二硝基酚指示劑來調(diào)節(jié)酸堿度，以獲得更好的顯色效果。而二硝基酚（ 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚，如圖 1）有較強(qiáng)的健康危害，致突變性、DNA抑制和生殖毒性，成人口服致死量約1 g，可通過吸入、食入、經(jīng)皮膚等途徑吸收。同時(shí)，二硝基酚又具有危險(xiǎn)特性，遇火種、高溫、摩擦、震動或接觸堿性物質(zhì)、氧化劑時(shí)均易引起爆炸，已被列入公安部確定、公布的《易制爆危險(xiǎn)化學(xué)品名錄》，很多廠家已禁售，購買非常困難。因此，有必要開展該檢測法中二硝基酚的替代指示劑研究。

圖1 2,4-二硝基酚和 2,6-二硝基酚結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為浙江省柑橘園 0～30 cm土壤，過 2 mm篩孔風(fēng)干。

1.2 儀器設(shè)備

電子天平（AR1502CN），臺式恒溫振蕩器（THZ-D），紫外可見分光光度計(jì)（UV-2600）,數(shù)顯恒溫水浴鍋（GHH- 6）等。

1.3 試劑配置

1.3.1 二硝基酚指示劑：稱取 0.20 g 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚溶于100mL水中。甲基橙指示劑：稱 0.10 g甲基橙溶于100mL脫鹽水中，搖均即可。

1.3.2 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 5 mg/L）和鉬銻抗顯色劑參照NY/T 1121.7-2014中的方法。

1.4 方法

浸提：稱取 5.00 g試樣于200mL塑料瓶中，加入氟化銨-鹽酸浸提劑50.00mL，振蕩30min（180±20r/min），立即用無磷濾紙干過濾。

二硝基酚為指示劑測定方法：吸取濾液10.00mL于50mL容量瓶，加入10mL硼酸溶液，搖勻，加水至30mL左右，再加入 2滴二硝基酚指示劑，用硫酸溶液和氨水溶液調(diào)節(jié)至溶液剛顯微黃色，加入 5.00mL鉬銻抗顯色劑，用水定容至50mL，在30℃恒溫水浴中靜置30min，用 1cm光徑比色皿在波長700nm處，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的零點(diǎn)調(diào)零后進(jìn)行比色測定。同時(shí)進(jìn)行空白溶液的測定。

替代指示劑測定方法：其余條件不變，用替代指示劑來調(diào)節(jié)試液酸堿度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取 5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、 1.00mL、 2.00mL、 4.00mL、 6.00mL、8.00mL、10.00mL于50mL容量瓶中，分別按要求加入浸提劑，硼酸溶液，指示劑，顯色劑，并用水定容至刻度，充分搖勻，即得含磷0.00mg/L、 0.10mg/L、 0.20mg/L、 0.40mg/L、0.60mg/L、 0.80mg/L、 1.00mg/L 的磷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。比色參照上述樣品測定方法。

2 結(jié)果分析

2.1 替代指示劑的選擇

NY/T1121.7-2014標(biāo)準(zhǔn)中，以 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚用作酸堿指示劑，其變色范圍是pH為 2.4（無色）～ 4.0（黃色）。在替代指示劑的選擇上，盡量要靠近這個(gè)變色范圍。根據(jù)酚酞、石蕊、甲基紅、溴甲酚綠等常用指示劑的變色范圍，發(fā)現(xiàn)甲基橙指示劑較符合條件。甲基橙，又名 4-｛[ 4-(二甲氨基)苯基]偶氮基｝苯磺酸鈉鹽（圖 2），其作為酸堿指示劑，變色范圍是pH為 3.1（紅）～4.4（黃）。

圖2 甲基橙結(jié)構(gòu)圖

2.2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用不同的指示劑調(diào)節(jié)酸堿，均有明顯的突變點(diǎn)，以甲基橙作為指示劑的試液，突變點(diǎn)為橙紅色至橙黃色。從制作的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3， 4）可以看出，指示劑對吸光度的斜率影響不大，在磷濃度 0.00～ 1.00mg/L范圍內(nèi)均具有良好的線性，R能達(dá)到0.9999。在實(shí)際顯色中，以二硝基酚為指示劑調(diào)酸堿后，最終顯色為藍(lán)色，磷濃度越高，藍(lán)色越深（圖5）；而采用甲基橙作為指示劑，顯色會偏紅，磷濃度越低，偏紅越明顯，磷濃度越高，顯色逐漸趨于藍(lán)色（圖 6）。

圖3 以二硝基酚為指示劑調(diào)酸堿后的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 以甲基橙為指示劑調(diào)酸堿后的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 以二硝基酚為指示劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色效果

圖6 以甲基橙為指示劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色效果

2.3 實(shí)際樣品及質(zhì)控樣測定

實(shí)驗(yàn)選擇了12個(gè)酸性土樣，及一個(gè)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07458（pH為 6.14± 0.07），對有效磷含量值進(jìn)行測定。每個(gè)試樣做三個(gè)平行樣，測定數(shù)據(jù)以平均值表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1。以二硝基酚為指示劑和以甲基橙為指示劑測得的實(shí)際樣品土壤有效磷含量誤差均已用絕對誤差表示。根據(jù)NY/T 1121.7-2014的精密度要求，當(dāng)測定值＞20 mg/kg，相對相差≤ 5%；當(dāng)測定值為10～20 mg/kg，絕對差值≤ 1.0 mg/kg；當(dāng)測定值＜10 mg/kg，絕對差值≤ 0.5 mg/kg，使用兩種指示劑后測得的土壤有效磷結(jié)果符合誤差要求。

表1 兩種指示劑在實(shí)際樣品和質(zhì)控樣中的結(jié)果比較

GBW07458為土壤有效態(tài)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作為質(zhì)控樣，其可驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，能有效地監(jiān)控試驗(yàn)過程，控制檢測質(zhì)量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測得的GBW07458有效磷(氟化銨浸提)含量在其標(biāo)準(zhǔn)范圍（32± 4mg/kg）內(nèi)。

3 結(jié)論

經(jīng)過理論分析和實(shí)驗(yàn)比對驗(yàn)證，甲基橙可作為二硝基酚的替代指示劑，進(jìn)行橘園酸性土有效磷的測定。