劉自強，農(nóng)璐琪，韓夢雨，訾迎新，孟歡，鄧宇，鄧婷婷，金明*

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 102488；2.中日友好醫(yī)院 眼科，北京 100029

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)是指視網(wǎng)膜靜脈血液循環(huán)發(fā)生障礙，引起視網(wǎng)膜相應區(qū)域出血、滲出及水腫的眼病[1]，其并發(fā)癥黃斑水腫能引起患者視力下降甚至導致失明。RVO癥狀與中醫(yī)“暴盲”“視瞻昏渺”類似。目前多數(shù)醫(yī)家認為，RVO主要是由各種原因?qū)е碌拿}絡瘀阻、血行不暢而溢于脈外、遮蔽神光所致[2]。

丹參為植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的根及根莖，其主要功效為活血祛瘀、止痛等，臨床上常用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、月經(jīng)不調(diào)等疾病[3-4]。丹參目前是眼科臨床上常用的活血化瘀藥，對RVO有一定的治療作用。樊曦等[5]研究發(fā)現(xiàn)，丹參聯(lián)合三七口服給藥后，可明顯降低RVO模型大鼠血小板黏附率，預防視網(wǎng)膜靜脈血栓形成。以丹參為主要成分的中成藥復方血栓通膠囊[6]、丹紅化瘀口服液[7]等也已被證實對RVO有一定治療作用。相關研究發(fā)現(xiàn)，使用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液能有改善效視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞患者的臨床癥狀和血液流變學相關指標[8-9]。張錫鋼等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用丹參注射液離子導入治療早期RVO患者可提高臨床療效。然而，目前丹參治療RVO的作用機制尚不明確，且中藥有效成分復雜，僅通過動物實驗等探究其作用機制存在一定的困難。

網(wǎng)絡藥理學以多學科為基礎，闡明藥物治療疾病的作用靶點和信號通路，這與中藥多成分、多靶點治療疾病類似[11-12]。因此，本研究通過篩選丹參的有效成分及相關疾病靶點，獲得丹參和RVO的交集靶點，構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡和“藥物-有效成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡，進行生物學過程和通路分析，以期為臨床使用丹參治療RVO提供參考。

1 材料與方法

1.1 丹參有效成分及靶點的獲取與篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)[13]檢索丹參的有效成分，以藥物口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18及口服藥物Caco-2細胞滲透率>0.4作為篩選條件，獲得丹參的主要有效成分及其相關靶點。

1.2 疾病相關靶點的獲取

應用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www. genecards. org/)，以“retinal vein occlusion”為關鍵詞進行檢索，獲得RVO相關的疾病靶點。將丹參有效成分靶點和RVO靶點取交集，并制作韋恩圖。

1.3 PPI網(wǎng)絡的構建

在STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)構建丹參活性成分靶蛋白和RVO相關靶蛋白的PPI網(wǎng)絡圖。

1.4 藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡的構建

應用Cytoscape 3.7.2軟件分析數(shù)據(jù)，構建藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡。

1.5 富集分析

采用ClusterProfiler R軟件對丹參治療RVO的作用靶點進行基因本體(GO)注釋分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析[14]，探討丹參有效化學成分治療RVO的作用機制。

2 結果

2.1 丹參有效成分

在TCSMP數(shù)據(jù)庫中，將丹參有效成分按OB、DL及Caco-2細胞滲透率條件進行篩選后，最終得出41個有效成分，分別是丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、丹參新醌等，見表1。獲得丹參有效成分對應靶點70個。

2.2 疾病靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得RVO的疾病靶點1705個，與丹參有效成分靶點的交集靶點46個，使用ClusterProfiler R軟件繪制疾病靶點與藥物成分靶點韋恩圖，見圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡

通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫構建構建丹參活性成分靶點和RVO相關靶點的PPI網(wǎng)絡，見圖2。

圖2 丹參與RVO靶點的PPI網(wǎng)絡

2.4 藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡

使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制丹參治療RVO的藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡，見圖3。在該網(wǎng)絡中，共包含節(jié)點83個，其中丹參、RVO節(jié)點各1個，丹參有效成分節(jié)點35個(表1內(nèi)41個丹參有效成分中，有6個成分無對應的RVO靶點)，丹參治療RVO的潛在作用靶點46個，含邊354條。其中丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ等成分相關的節(jié)點數(shù)較多，是丹參的主要有效成分。

注：紅色代表RVO；綠色代表丹參；黃色代表丹參治療RVO有效成分；藍色代表交集靶點。圖3 丹參治療RVO的藥物-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡

2.5 GO功能富集分析

通過ClusterProfiler R軟件對上述獲得的46個關鍵靶點進行GO注釋分析，丹參治療RVO的主要富集過程包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結合、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)結合、血紅素結合、銨離子結合、DNA結合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、四吡咯結合、酰胺結合、氧化還原酶活性、類固醇結合、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)活性、肽結合、腎上腺素能受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)結合等。其中關鍵靶點(前20位)見圖4。

圖4 丹參治療RVO靶點的GO富集分析(前20位)

2.6 KEGG通路富集分析

借助ClusterProfiler R軟件對丹參與RVO的共同靶點進行KEGG通路富集分析，篩選出作用通路共76條，包括乙型肝炎、麻疹、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、內(nèi)分泌抵抗、催乳素信號途徑、丙型肝炎、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、人巨細胞病毒感染、細胞凋亡、腫瘤壞死因子信號途徑、弓形蟲病、磷脂腺肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、人T細胞白血病病毒1型感染、利什曼病、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路、Th17細胞分化、多種凋亡、膽堿能突觸等相關。其中最為顯著的20條代謝通路見圖5。

圖5 丹參治療RVO靶點的KEGG富集分析(前20位)

3 討論

RVO多發(fā)生于中老年患者，目前發(fā)病機制不完全明確，致使其發(fā)生的因素有年齡增長、高血壓、糖尿病、血脂異常、心血管疾病等[15]，并發(fā)癥黃斑水腫是引起視力受損的主要原因。中醫(yī)認為RVO的病因病機復雜，其發(fā)生的根本原因在于脈絡瘀阻、血溢于脈外。早在《證治準繩·雜病·七竅門》中就已提及該病的發(fā)病機制，現(xiàn)代學者多認為血瘀是RVO的重要病理基礎。李學晶等[16]認為，RVO基本病機為氣虛血瘀。孟凡超等[17]認為瘀是RVO發(fā)病之關鍵，與氣、火、痰交雜致病。

丹參作為中國傳統(tǒng)中藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛之功效，而RVO患者正對此病機。本研究中TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索結果和藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡分析結果顯示，丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、丹參新醌等化合物相關的節(jié)點數(shù)較多，是丹參的主要有效成分。其中，丹參酮ⅡA是目前研究的熱點之一。楊敏[18]發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能改善患者血液的纖溶及抗凝活性，降低全血比黏度等水平，從而改善凝血功能及相關血流變指標，血液黏稠度增高是RVO發(fā)生的主要危險因素。曹珊等[19]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以降低患者血清中IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子水平，而上述炎性因子在RVO發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。

丹參治療RVO的PPI網(wǎng)絡分析結果顯示，46個靶蛋白中，節(jié)點度值排序前10位的依次為Fos、骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)、胱天蛋白酶3(CASP3)、雌激素受體1(ESR1)、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、髓樣β(A4)前體蛋白(APP)、細胞周期素1(CCND1)、Jun、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)，可能是丹參治療RVO的關鍵靶點。其中PTGS2、STAT3的表達與炎癥密切相關[21-22]，RELA在調(diào)控炎癥的細胞信號系統(tǒng)/NF-κB信號通路中起著極其重要的作用[23]，炎性反應是RVO發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。Fos、MYC在調(diào)控細胞生長、分裂、增殖等方面發(fā)揮重要作用，能促進組織的修復和再生，與改善凝血、微循環(huán)、血液流變學及血流動力學指標等密切相關[24]。CASP3參與細胞凋亡過程的調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)，丹參治療RVO主要涉及81個生理過程和76條通路。KEGG結果顯示，丹參的主要作用可能與細胞凋亡、TNF信號通路、IL-17信號通路等有關。TNF是機體抗炎和免疫調(diào)節(jié)的主要細胞因子之一，研究表明，RVO的產(chǎn)生及嚴重程度與房水或玻璃體液中TNF-α水平呈正相關[25]。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達來參與RVO的發(fā)生。Yamawaki等[27]發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過激活血管內(nèi)皮生長因子來增強炎性反應，促進新生血管生成。IL-17是炎癥反應的早期啟動因子，IL-17與受體結合后，可通過促分裂原活化蛋白激酶途徑和NF-κB途徑發(fā)揮其抗炎作用[28]。Li等[29]研究認為，IL-17可能通過細胞骨架重塑、血管內(nèi)皮生長因子等參與RVO新生血管形成。炎性反應和新生血管形成是RVO發(fā)生發(fā)展中最為重要的病理反應。

本研究的網(wǎng)絡藥理學分析也存在一定的局限性，首先，丹參有效化學成分的靶蛋白譜廣，加之RVO病理機制復雜，如何通過數(shù)學計算在網(wǎng)絡靶標的基礎上準確找到丹參治療RVO的多種靶蛋白及作用途徑，值得進一步探索；其次，目前關于丹參、RVO的數(shù)據(jù)庫信息及臨床、實驗數(shù)據(jù)的積累還有很大不足，同時缺乏對活性成分定量檢測，故本次研究僅為預測性分析，后期應進行相關實驗予以驗證[11，30]；最后，網(wǎng)絡藥理學是將復雜生物系統(tǒng)間的相互作用抽象表達為網(wǎng)絡，故還需要從理論和實際應用等方面深入理解丹參治療RVO的內(nèi)在調(diào)控機制[31]。

4 結論

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，分析了丹參與RVO疾病靶點之間的復雜網(wǎng)絡關系，發(fā)現(xiàn)丹參可能是通過調(diào)控炎癥反應、血管生成、凝血過程和細胞凋亡等發(fā)揮對RVO的治療作用，但本研究僅為預測分析，建議后期應注重對預測的靶點和通路進行相關實驗驗證，以期為丹參治療RVO提供更為確切的臨床使用依據(jù)。