張婷，王宏雅，魏桂杰，趙雯雯，孫秀蕊，張哲，馬鵬凱，張玉杰

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge或蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根[1]，是重要的補(bǔ)氣藥之一，在抗衰老方面具有重要作用[2-4]。吳爽等[5]研究結(jié)果表明，發(fā)酵黃芪可提高自然衰老大鼠血清及腦組織抗氧化應(yīng)激指標(biāo)水平。耿廣琴等[6]研究結(jié)果表明，黃芪提取物能顯著提高衰老模型小鼠腦組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，顯著降低丙二醛(MDA)水平，明顯減輕海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)衰老。閆晉晉等[7]研究結(jié)果表明，黃芪總提取物可以明顯提高D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠的機(jī)體抗氧化及抗衰老能力。廖勇梅等[8]研究結(jié)果表明，穴位注射黃芪對D-半乳糖引起的皮膚衰老具有一定的預(yù)防與延緩作用。有關(guān)黃芪抗衰老作用機(jī)制的研究一直備受重視。文獻(xiàn)研究表明，黃芪及其活性成分對衰老基因的調(diào)控、細(xì)胞的凋亡有一定的積極作用[9]，但其抗衰老成分及機(jī)制尚待明確。

衰老是指生物個體隨年齡的增長，其細(xì)胞、組織、器官發(fā)生系統(tǒng)性病變，從而導(dǎo)致衰老相關(guān)疾病的發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害其健康[10]。已有研究表明，衰老與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、干細(xì)胞衰竭等有關(guān)[11]，但是衰老及衰老相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制有待深入研究。

中藥具有多成分、多靶點的特點，且不同成分之間還具有一定的協(xié)同作用[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)和計算生物學(xué)，從整體角度闡釋藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性，適用于中藥藥效機(jī)制研究[13-14]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究黃芪多成分、多靶點、多通路的作用特點，探討黃芪抗衰老的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分的收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，hettp：//lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)輸入關(guān)鍵詞“huangqi”進(jìn)行檢索，得到其化學(xué)成分，設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18篩選活性化合物，同時納入文獻(xiàn)報道的具有明顯藥理活性的成分[15]。

1.2 黃芪候選成分潛在靶點預(yù)測

利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http：//59.78.98.102/pharmmapper/index.php)[16]篩選得到黃芪候選活性成分的mol2格式文件，獲取靶點蛋白編號(PDB ID)、名稱和得分(fit score)。Fit score體現(xiàn)了分子與靶點之間的匹配程度，其值大小與匹配程度呈正相關(guān)。在UniProt數(shù)據(jù)庫中輸入篩選獲得的fit score>3的蛋白編號，作為黃芪主要活性成分的潛在作用靶點。

1.3 衰老靶點篩選

在OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards. org)中輸入關(guān)鍵詞“aging”，搜索與衰老相關(guān)的疾病靶點。運用Venny平臺(http：//bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/)將黃芪藥效成分靶點與衰老相關(guān)靶點取交集，得到黃芪治療衰老的交集靶點。使用Omicshare平臺(http：//www.omicshare.com)繪制黃芪治療衰老靶點韋恩圖。

1.4 黃芪-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述黃芪候選化合物、衰老、衰老與活性成分的交集靶點作為節(jié)點，通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建黃芪-成分-靶點-衰老網(wǎng)絡(luò)[17]。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

在STRING 數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)中輸入黃芪治療衰老的潛在作用靶點，設(shè)置條件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，獲取蛋白相互作用信息，并利用Cytoscape 3.2.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)節(jié)點度值大小篩選出核心靶點。

1.6 分子對接驗證

以黃芪關(guān)鍵活性成分為配體，通過PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)查找蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的靶蛋白3D結(jié)構(gòu)作為受體，利用CB-Dock網(wǎng)站(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/)進(jìn)行分子對接。

1.7 基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

為探究靶標(biāo)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與功能，將交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)定P≤0.05、Q≤0.05，對相互作用的靶點進(jìn)行GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性化合物及靶點篩選

通過TCMSP查找黃芪活性成分，設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18，篩選得到活性化合物20個，納入文獻(xiàn)報道的活性成分后共得到24個化合物[18]。另外，黃芪皂苷Ⅰ～Ⅳ的OB和DL值雖較低，但研究顯示這些成分為黃芪的關(guān)鍵活性成分，且藥理作用明顯，因此將這4個成分也納入后續(xù)黃芪抗衰老作用的機(jī)制研究中。按照1.2項下方法共篩選得到黃芪活性成分靶點385個。

2.2 衰老及相關(guān)疾病靶點

在OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“aging”作為關(guān)鍵字進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)23 997個潛在作用靶點。將黃芪有效成分的靶點與衰老的靶點取交集，得到與黃芪抗衰老作用相關(guān)的靶點377個，結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪抗衰老靶點韋恩圖

2.3 黃芪-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建黃芪-成分-靶點-衰老網(wǎng)絡(luò)(圖2)。由圖2可知，活性成分和多數(shù)靶點具有較多的交互作用，充分說明黃芪是通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的方式起到抗衰老的作用，其中活性成分黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ、芒柄花素、異鼠李素、山柰酚和槲皮素均能與10個以上的靶點相連接，推測這些成分是黃芪抗衰老的主要活性成分。

注：紅色表示疾??；綠色表示藥物；黃色表示黃芪活性成分；橘色表示預(yù)測靶點。圖2 黃芪化合物-靶點-衰老作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將得到的377個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲取PPI關(guān)系，結(jié)果見圖3。根據(jù)度值大小篩選出排名前10的關(guān)鍵靶蛋白，結(jié)果見表1。

圖3 黃芪抗衰老交集靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

表1 黃芪抗衰老PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點

2.5 分子對接

通過PDB數(shù)據(jù)庫查找黃芪活性成分黃芪皂苷Ⅰ(MOL000401)、黃芪皂苷Ⅳ(MOL000407)、槲皮素(MOL000098)、山柰酚(MOL000422)與靶點Akt1、MAPK1相互作用的三維結(jié)構(gòu)，下載化合物MOL結(jié)構(gòu)式，分別導(dǎo)入CB-Dock網(wǎng)站進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表2。結(jié)合能<0說明受體與配體間可以自發(fā)結(jié)合，黃芪4種關(guān)鍵活性成分與靶蛋白的結(jié)合均較穩(wěn)定，結(jié)果見圖4。

表2 黃芪抗衰老主要活性成分與靶蛋白Akt1和MAPK1的對接結(jié)果

注：A.黃芪皂苷Ⅰ與Akt1；B.黃芪皂苷Ⅳ與Akt1；C.槲皮素與Akt1；D.山柰酚與Akt1；E.黃芪皂苷Ⅰ與MAPK1；F.黃芪皂苷Ⅳ與MAPK1；G.槲皮素與MAPK1；H.山柰酚與MAPK1。圖4 黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅳ、槲皮素、山柰酚與靶蛋白Akt1和MAPK1的對接分析

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫中輸入衰老和黃芪活性成分的交集靶點，分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋富集分析。GO分析由生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)3部分組成。根據(jù)P值大小，分別列舉排名前20的GO條目(圖5)。由圖5可以看出，作用靶點主要富集在對金屬離子的響應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝等生物過程；涉及核受體活動、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、抗氧化活性、有機(jī)酸結(jié)合等分子功能；發(fā)生在膜筏、囊腔、突觸前膜、突觸后膜等細(xì)胞組分。根據(jù)P≤0.05和Q≤0.05，KEGG富集得到信號通路161條，選取前20條KEGG信號通路，通路詳細(xì)信息見表3。分析顯示，靶點顯著富集于晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路、人類巨細(xì)胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化及與癌癥相關(guān)的多個信號通路。

注：A.BP；B.MF；C.CC。圖5 黃芪抗衰老作用靶點的GO富集分析

表3 黃芪抗衰老作用靶點KEGG通路信息

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討黃芪抗衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制。由圖2可知，黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ、芒柄花素、異鼠李素、山柰酚和槲皮素等化合物為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，推測這些化合物可能是黃芪抗衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)。朱嘉歡等[19]研究結(jié)果表明，芒柄花素可顯著促進(jìn)衰老造血干細(xì)胞增殖和降低細(xì)胞衰老率。顧藝婧等[20]通過體內(nèi)外實驗探究槲皮素對骨相關(guān)細(xì)胞衰老的影響，證實槲皮素可通過抑制細(xì)胞衰老緩解由雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失。章詩迪[21]研究結(jié)果表明，環(huán)黃芪醇提取物具有一定的端粒酶激活作用，繼而提示其具有抗衰老作用。這些實驗成果進(jìn)一步驗證了本研究預(yù)測結(jié)果的可靠性。

黃芪化合物-靶點-衰老網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，Akt1、MAPK1、Jun、IL-6和MAPK8與多個化合物具有交互作用且度值較高，在網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，提示其可能是黃芪抗衰老的潛在靶點。Akt可通過抑制叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，從而破壞sestrin 3等蛋白對活性氧(ROS)的清除過程，而ROS的累積被證明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生存周期和衰老過程[22]。MAPK信號通路是控制細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、存活和凋亡等多種基本細(xì)胞進(jìn)程的重要通路[23]。c-Jun癌蛋白與其他Jun/Fos成員通過異二聚作用形成激活子蛋白-1(AP-1)，而AP-1通過控制基因表達(dá)調(diào)節(jié)一些重要的細(xì)胞功能，如細(xì)胞周期、遷移、增殖和凋亡[24]。研究表明，旁分泌的IL-6可以誘導(dǎo)初始細(xì)胞增殖，自分泌的IL-6可導(dǎo)致細(xì)胞衰老，限制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和侵襲性增長，在垂體腺瘤發(fā)生與發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[25]。

分子對接結(jié)果表明，黃酮和皂苷類化合物與靶蛋白Akt1和MAPK1結(jié)合性較好，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測靶點的可靠性提供有力依據(jù)。GO功能顯著富集在氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝等生物過程。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃芪可通過AGE-RAGE信號通路、人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染及與癌癥相關(guān)的多個信號通路起到抗衰老作用。研究表明，AGEs通過與RAGE結(jié)合促使細(xì)胞內(nèi)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活，導(dǎo)致多種細(xì)胞因子與生長因子的合成與釋放，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多[26]。HCMV作為常見的病原體，在老年人群中的感染率很高，和多種慢性疾病共同作用于機(jī)體，影響機(jī)體免疫功能[27]。癌癥相關(guān)通路表明，衰老與腫瘤密切相關(guān)。已有研究表明，衰老和腫瘤互相影響、互相促成，衰老是腫瘤發(fā)生的一個重要風(fēng)險因素，腫瘤發(fā)生一定程度上是衰老的自然結(jié)果[28]。

本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上，對黃芪的活性成分和其抗衰老過程中的多靶點、多途徑特性進(jìn)行了探討，初步解釋了黃芪抗衰老的作用機(jī)制，為黃芪抗衰老活性進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗驗證及抗衰老藥物的篩選和評價提供參考。