劉斯琪，彭玉帥，郭麗娜，陶志，王莎，王如峰

北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院，北京 102488

金蓮花為毛莨科多年生草本植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花，由于其具有抗病毒、抗菌、抗炎等藥理活性被廣泛用于治療咽炎、扁桃體炎、急性中耳炎和急性淋巴管炎等疾病[1-3]。金蓮花中的主要化學成分為黃酮類、酚酸類和生物堿類物質(zhì)[2，4]。其中黃酮類物質(zhì)中大部分為黃酮碳苷，即黃酮骨架的C-8通過C-C鍵與糖基相連，包括葒草素、牡荊素、異當藥黃素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷、2″-O-(2?-甲基丁?；?葒草素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、葒草素-6?-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-2″-O-β-L-半乳糖苷(葒草素-6?-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷)、牡荊素-6?-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷、金蓮花碳苷Ⅰ～Ⅲ等[5-8]。除此之外還有黃酮氧苷，如槲皮素和異槲皮素[9]。

中藥藥效是多成分多靶點的協(xié)同效應和多成分單靶點疊加效應的共同結(jié)果，并且中藥的成分需要被吸收入血后才能夠到達相應的靶器官發(fā)揮作用，因此真正起效的應該是血液中的原型成分和代謝產(chǎn)物[10]。目前研究認為，金蓮花中的主要化學成分是黃酮類化合物[11]，但其在體內(nèi)真正起效的成分依然不明確。鑒于此，本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對金蓮花中5個典型的黃酮類化合物體內(nèi)代謝產(chǎn)物及代謝途徑進行研究，以期進一步明確金蓮花中所含主要物質(zhì)在體內(nèi)的代謝過程，為合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

1525型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；LTQ ORBTTRAP XL型質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；甲酸、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；1，2-丙二醇、水合氯醛(分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司)；葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、異槲皮素均為本實驗室從金蓮花中提取分離，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測定其純度均大于98%。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，由北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2011-0004。實驗前禁食不禁水24 h。

2 方法

2.1 色譜條件

Welch Ultimate C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，有預柱；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件分別為葒草素：0～9 min，5%～25%A；9～12 min，25%A；12～17 min，25%～45%A；17～24 min，45%～60%A；24～29 min，60%～80%A；29～31 min，80%～5%A；31～35 min，5%A。葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷：0～12 min，5%～25%A；12～15 min，25%～27%A；15～27 min，27%～45%A；27～30 min，45%～70%A；30～32 min，70%～5%A；32～35 min，5%A。牡荊素：0～6 min，5%～15%A；6～16 min，15%～35%A；16～20 min，35%～50%A；20～25 min，50%～80%A；25～27 min，80%～5%A；27～30 min，5%A。2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素：0～7 min，5%～25%A；7～18 min，25%～55%A；18～25 min，55%～80%A；25～27 min，80%～5%A；27～30 min，5%A。異槲皮素：0～20 min，5%～70%A；20～22 min，70%～5%A；22～25 min，5%A；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

Accela 600型泵；電噴霧離子源(ESI)；負離子掃描模式；掃描范圍為m/z100～1000；毛細管溫度為350 ℃；毛細管電壓為-35 V；氣化溫度為300 ℃；鞘流氣體積流量為17 L·min-1。

2.3 藥品制備

精密稱定葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，超聲溶解于水中。精密稱定葒草素、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、異槲皮素，用30% 1，2-丙二醇水溶液超聲溶解。葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素、異槲皮素終質(zhì)量濃度分別為1.60、3.00、1.00、3.00、1.25 mg·mL-1。

2.4 給藥及采血

大鼠隨機分為5組，每組10只，其中5只為給藥組，5只為空白組。葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、異槲皮素分別按照10.00、15.00、6.25、15.00、7.50 mg·kg-1尾靜脈注射給藥，各對照組給予相同體積的蒸餾水，給藥后10 min眼眶靜脈叢取血。

2.5 樣品處理

取血后靜置30 min，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑為11.5 cm)。各組取空白血清和含藥血清各500 μL，分別加入3倍體積的乙腈渦旋混勻，沉淀蛋白，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為6.6 cm)。吸取上清液1700 μL，于40 ℃氮氣吹干，再用甲醇170 μL復溶。超聲溶解2 min，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為6.6 cm)。吸取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

3 結(jié)果

各組樣品的HPLC-MS/MS總離子流圖見圖1，原型成分及代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式見圖2～3，原型成分及代謝產(chǎn)物的碎片信息見表1～2。

注：A.葒草素組空白血清；A′.葒草素組含藥血清；B.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷組空白血清；B′.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷組含藥血清；C.牡荊素組空白血清；C′.牡荊素組含藥血清；D.2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素組空白血清；D′.2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素組含藥血清；E.異槲皮素組空白血清；E′.異槲皮素組含藥血清。圖1 各組大鼠空白血清和含藥血清的總離子流圖

圖2 金蓮花中5個原型成分結(jié)構(gòu)式

圖3 金蓮花中5個原型成分在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式

表1 金蓮花中5個原型成分質(zhì)譜信息

表2 金蓮花中5個原型成分在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息

3.1 葒草素代謝產(chǎn)物

葒草素(m/z447.09)共產(chǎn)生5種代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M1(m/z527.05)存在二級碎片m/z447.12、437.08、407.09，提示其可能為硫酸酯結(jié)合產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M2(m/z559.02)存在二級碎片m/z479.15，表明其可能為硫酸酯結(jié)合產(chǎn)物，并且根據(jù)其相對分子質(zhì)量、分子式及其他二級碎片可推斷M2在M1的基礎(chǔ)上又發(fā)生了2個位置的羥基化反應。代謝產(chǎn)物M3(m/z623.13)存在二級碎片m/z447.17、533.13、503.08，表明其為葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M4(m/z637.14)存在二級碎片m/z461.20、547.17、517.17，表明其為甲基化和葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，結(jié)合位置為黃酮母核。代謝產(chǎn)物M5(m/z461.11)存在二級碎片m/z371.10、341.10，說明其為甲基化產(chǎn)物。

3.2 葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷代謝產(chǎn)物

葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(m/z609.15)共產(chǎn)生2種代謝產(chǎn)物。根據(jù)代謝產(chǎn)物M6(m/z447.10)的二級碎片m/z357.19和327.07可推斷M6為O-苷鍵斷裂后產(chǎn)生的葒草素。代謝產(chǎn)物M7(m/z623.17)存在二級碎片m/z443.07和428.17，表明其可能為甲基化產(chǎn)物，m/z371.17和341.03提示甲基結(jié)合在黃酮母核上，并且m/z463.23提示發(fā)生了逆狄爾斯-阿德爾反應(RDA)。據(jù)此進一步推斷甲基是結(jié)合于A環(huán)，又因5-OH的結(jié)合能力強于7-OH，推斷結(jié)合位置為5-OH。

3.3 牡荊素代謝產(chǎn)物

牡荊素(m/z431.10)共產(chǎn)生3種代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M8(m/z607.13)存在二級碎片m/z431.12，說明發(fā)生了葡萄糖醛酸結(jié)合反應；同時碎片m/z558.80、487.20、413.03、311.11進一步證明了此推斷。代謝產(chǎn)物M9(m/z463.09)和M10(m/z463.09)為同分異構(gòu)體，根據(jù)二級碎片及相對分子質(zhì)量推測兩者均為羥基化產(chǎn)物。兩者存在互補二級碎片m/z287、175，該碎片來源于RDA裂解，據(jù)此推斷羥基化發(fā)生于黃酮母核的B環(huán)。

3.4 2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素代謝產(chǎn)物

2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素(m/z515.15)共產(chǎn)生5種代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M11(m/z691.19)存在二級碎片m/z515.29，提示其為葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M12(m/z707.18)存在二級碎片m/z689.21、531.12，表明其為羥基化和葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M13(m/z431.10)和牡荊素具有相同的相對分子質(zhì)量和二級碎片，表明其為牡荊素。代謝產(chǎn)物M14(m/z607.13)和M15(m/z607.13)為同分異構(gòu)體，兩者與M8有相同的相對分子質(zhì)量和許多相同的二級碎片，表明M14和M15在牡荊素基礎(chǔ)上發(fā)生了葡萄糖醛酸結(jié)合反應，即2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素去甲基丁?；?，再發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應。

3.5 異槲皮素代謝產(chǎn)物

異槲皮素(m/z463.09)共產(chǎn)生5種代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M16(m/z653.14)、M17(m/z653.14)和M18(m/z653.14)互為同分異構(gòu)體，均存在二級碎片m/z477，表明三者為葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。m/z477為異槲皮素加1個甲基，表明其為甲基化產(chǎn)物。M18存在二級碎片m/z342.14，表明M18的黃酮母核發(fā)生了RDA裂解，而M16和M17并沒有出現(xiàn)該碎片，提示M18是葡萄糖醛酸結(jié)合反應和甲基反應發(fā)生在異槲皮素A環(huán)的產(chǎn)物，M16和M17是2種反應發(fā)生在異槲皮素B環(huán)的產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物M19(m/z543.05)存在二級碎片m/z380.94、301.08，提示黃酮母核的1個游離羥基上發(fā)生了硫酸酯結(jié)合反應。代謝產(chǎn)物M20(m/z477.11)存在二級碎片462.15，表明其可能為異槲皮素的甲基化結(jié)合產(chǎn)物。M20的相對分子質(zhì)量和二級碎片與文獻報道的異鼠李素-3-O-葡萄糖苷一致[12-13]，故可以確定M20為異槲皮素的3′-OH發(fā)生了甲基化反應的產(chǎn)物。5種黃酮類化合物的代謝途徑見圖4。

注：A.葒草素；B.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖；C.牡荊素；D.2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素；E.異槲皮素。圖4 5個黃酮類化合物的代謝途徑

4 討論

許多代謝產(chǎn)物由于其穩(wěn)定的化學性質(zhì)及良好的生物活性而比原型成分具有更好的藥效，這些代謝產(chǎn)物就是潛在的活性物質(zhì)，有重要的研究意義。本研究采用HPLC-MS/MS測定了金蓮花5個主要黃酮類成分的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)未發(fā)生C-苷鍵斷裂的現(xiàn)象，表明黃酮C-苷鍵結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定[14]。5個化合物發(fā)生了氧化、甲基化、硫酸酯結(jié)合、葡萄糖醛酸結(jié)合等Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應，其中葒草素發(fā)生了甲基化、硫酸酯結(jié)合和葡萄糖醛酸結(jié)合反應等Ⅱ相代謝反應，且硫酸化和甲基化基本不同時發(fā)生，而牡荊素則只發(fā)生了葡萄糖醛酸結(jié)合反應。由于牡荊素與葒草素相比在3′位少1個羥基，據(jù)此可推測，在黃酮母核B環(huán)的3′和4′位存在羥基時易在3′位發(fā)生甲基和硫酸酯基結(jié)合反應，在4′位發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應，該反應能夠增加原化合物的極性，從而利于排泄。

本實驗研究了葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素4種黃酮碳苷及異槲皮素1種黃酮氧苷的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)除了C-苷鍵難于水解外，異槲皮素連于C環(huán)上的O-苷鍵也不易水解，這與本課題組前期研究結(jié)果一致[15]。但葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷連于糖基上的O-苷鍵則發(fā)生了水解。通過靜脈注射給藥后，藥物可以通過血液循環(huán)進入肝臟代謝，因而可以確定連于黃酮母核上的黃酮O-苷鍵不能在肝臟進行水解代謝。結(jié)合本實驗室前期對金蓮花代謝產(chǎn)物的研究及相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)的代謝具有明顯規(guī)律。首先，黃酮氧苷的主要水解代謝發(fā)生在胃腸道中，會被水解為相應的苷和苷元，而黃酮碳苷則主要通過腸道微生物產(chǎn)生的水解酶進行水解代謝[16]；其次，在進入血液循環(huán)后黃酮類物質(zhì)會在肝臟多種酶的作用下發(fā)生羥基化等Ⅰ相代謝反應和葡萄糖醛酸結(jié)合、甲基化、硫酸酯化等Ⅱ相代謝反應，其中葡萄糖醛酸結(jié)合反應較易發(fā)生于7-OH位及4′-OH位。除此之外，還會由于肝腸循環(huán)而發(fā)生黃酮母核的A型和B型裂解反應；最后，黃酮類物質(zhì)可以在肝臟中發(fā)生乙?；磻猍15]，同時帶有?；狞S酮類物質(zhì)也可以在肝臟中發(fā)生水解反應脫?；?，如2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素。本研究結(jié)果為金蓮花黃酮類化合物的體內(nèi)代謝研究及金蓮花的進一步開發(fā)利用提供了參考。