張友弟，張 樂，江 明

0 引言

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成人最常見的白血病類型，也是最難治療的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一(成人原發(fā)性AML的5年總生存率是20%～30%)[1-2]。AML的特征是分化障礙和不受控制的增殖[3]。AML的發(fā)病率逐年增長，盡管目前的療法取得了進(jìn)步，但是易復(fù)發(fā)仍然是臨床上的關(guān)鍵問題。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是重要的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的生物合成和折疊、細(xì)胞和鈣的動態(tài)平衡。目前，ER被認(rèn)為是最新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的新焦點(diǎn)[4]。多種刺激可能會導(dǎo)致ER紊亂，包括鈣代謝紊亂、氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，這些統(tǒng)稱為ER應(yīng)激[5]。已有研究報道了ER的功能及其參與AML中的相關(guān)應(yīng)激途徑[6]。因此，靶向凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能對開發(fā)有效的白血病治療方法有啟示作用。辣椒素(Capsaicin,Cap)是辣椒屬植物辣椒中主要的刺激性成分，該化合物主要存在于辣椒和辣椒的白髓和膜中[7]。研究表明，辣椒素具有調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛止癢、抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、清除自由基等作用[8]。本研究觀察辣椒素對HL-60細(xì)胞的凋亡是否有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制是否與GRP78觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床治療AML提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞 人急性髓系白血病細(xì)胞系HL-60購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，辣椒素和兔抗人GRP78抗體購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自美國promega公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司，Salubrinal(ER應(yīng)激抑制劑)購自美國MCE公司，LipofectamineTM 3000購自美國Invitrogen公司，ShGRP78和shScramble購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，鼠抗人GAPDH抗體購自美國Biovision公司，山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購自美國Beckman-Coulter公司，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分。當(dāng)傳代3次后，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8檢測辣椒素毒性 HL-60細(xì)胞以3×103個/孔種到96孔板中，每孔100 μl。細(xì)胞分為：0 μmol/L辣椒素組[Cap(0)組]、10 μmol/L辣椒素組[Cap(10)組]、20 μmol/L辣椒素組[Cap(20)組]、40 μmol/L辣椒素組[Cap(40)組]、60 μmol/L辣椒素組[Cap(60)組]和80 μmol/L辣椒素組[Cap(80)組]，每組3個復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。將10 μl CCK-8試劑加到每個孔中。2 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量每孔細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.3 Wright-Giemsa染色 將HL-60細(xì)胞以5×104個/孔密度接種于12孔培養(yǎng)板，加入相應(yīng)濃度的辣椒素孵育24 h后，更換為無血清培養(yǎng)基。HL-60細(xì)胞用Wright試劑處理并培養(yǎng)24 h，PBS沖洗2次。HL-60細(xì)胞經(jīng)固定后，用Giemsa試劑染色。最后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

2.4 Salubrinal預(yù)處理HL-60細(xì)胞 以1×105個/孔接種于24孔板，用Salubrinal(15 μmol)預(yù)處理2 h后，再用辣椒素(60 μmol/L)處理24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將50 ng的shGRP78和shScramble分別轉(zhuǎn)入HL-60細(xì)胞中。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，再用辣椒素(60 μmol/L)處理24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 細(xì)胞流式術(shù) 各組細(xì)胞用冰PBS沖洗1次，在加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI后再用300 μl緩沖液重懸，將細(xì)胞在避光的室溫下孵育10 min。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，并使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

2.7 Western blot RIPA裂解液提取HL-60細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后，將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：兔抗人GRP78抗體(1∶1 000)、兔抗人GAPDH抗體(1∶2 000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 辣椒素的濃度篩選 CCK-8結(jié)果表明(圖1)，用不同濃度的辣椒素(0、10、20、40、60和80 μmol/L)處理HL-60細(xì)胞24 h后，HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活力受到辣椒素濃度的影響。當(dāng)辣椒素濃度為40、60、80 μmol/L時，HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活力在50%左右(P<0.001)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)辣椒素的濃度選擇40、60、80 μmol/L。

圖1 CCK-8用于檢測不同濃度的辣椒素對HL-60細(xì)胞活力的影響

3.2 辣椒素對HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響 Wright-Giemsa染色結(jié)果表明(圖2)，經(jīng)不同濃度辣椒素處理后的HL-60細(xì)胞出現(xiàn)：染色質(zhì)濃集，呈半月狀或指環(huán)狀，線粒體腫脹、空泡樣變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等變化；隨著辣椒素濃度的增加，HL-60細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少。

圖2 Wright-Giemsa染色觀察不同濃度的辣椒素對HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響

3.3 辣椒素對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果表明(圖3)，經(jīng)不同濃度辣椒素處理后的HL-60細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率隨著辣椒素濃度的增加而增加(P<0.001)。提示辣椒素顯著誘導(dǎo)了HL-60細(xì)胞的凋亡。

圖3 Annexin V-FITC/PI雙重染色方法用于檢測不同濃度的辣椒素對HL-60細(xì)胞凋亡的影響

3.4 辣椒素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳導(dǎo)的影響 Western blot結(jié)果表明，GRP78(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的主要標(biāo)志分子之一)蛋白的表達(dá)量隨著辣椒素濃度的升高而不斷增加(P<0.05，P<0.001，P<0.001。圖4A)。使用Salubrinal(ER應(yīng)激抑制劑)預(yù)處理HL-60細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過Salubrinal預(yù)處理可以明顯減少GRP78蛋白的表達(dá)(P<0.01。圖4B)。

圖4 Western blot檢測辣椒素對GRP78蛋白表達(dá)的影響

3.5 辣椒素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳導(dǎo)對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明(圖5)，Salubrinal預(yù)處理后，HL-60細(xì)胞凋亡率與辣椒素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)，提示辣椒素誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡依賴于ER應(yīng)激。

圖5 辣椒素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳導(dǎo)對HL-60細(xì)胞凋亡的影響

3.6 辣椒素對CRP78蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明(圖6)，與未經(jīng)任何處理的細(xì)胞組相比，辣椒素顯著增加GRP78蛋白表達(dá)(P<0.001)；辣椒素增加的GRP78蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)染shGRP78的HL-60細(xì)胞中下調(diào)(P<0.001)。

圖6 辣椒素對CRP78蛋白表達(dá)的影響

3.7 辣椒素通過GRP78誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 與未經(jīng)任何處理的細(xì)胞組相比，辣椒素顯著增加HL-60細(xì)胞凋亡(P<0.001)；在shGRP78轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞中，由辣椒素觸發(fā)的顯著凋亡也被消除(P<0.01)。見圖7。

圖7 辣椒素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過GRP78誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡的影響

4 討論

AML是起源于髓細(xì)胞前體的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是成年人中最常見的急性白血病[9]。AML是一種分子異質(zhì)性疾病，通常與不良預(yù)后相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子異常，將AML患者分為經(jīng)過風(fēng)險調(diào)整的化療的不同風(fēng)險類別[10]。由于AML的難治愈性或復(fù)發(fā)性，60歲以下的患者很少被治愈。對于60歲以上的患者，預(yù)后更差[11-12],因此,需要新的治療方法。

辣椒素是辣椒中的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛止癢、抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、清除自由基等作用[13]，例如，辣椒素通過抑制Wnt/β-catenin途徑抑制前列腺癌干細(xì)胞的活性[14]。研究顯示，辣椒素能誘導(dǎo)人黑素瘤細(xì)胞凋亡和自噬[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素可使HL-60細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃集，呈半月狀或指環(huán)狀等變化，且隨著辣椒素濃度的增加，HL-60細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少；經(jīng)不同濃度辣椒素處理后的HL-60細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率逐漸增加。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是多種細(xì)胞生理和病理事件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，包括對抗腫瘤藥物起反應(yīng)的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)以及3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜換能器的積累[16-17]。同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)Bax、Bcl-2的重要促凋亡家族成員。Bax對于調(diào)節(jié)不同刺激誘導(dǎo)的內(nèi)在凋亡通路是必需的[18]。越來越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是白血病進(jìn)展的重要機(jī)制，并參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[19]。本研究顯示，辣椒素顯著誘導(dǎo)了HL-60細(xì)胞的ER應(yīng)激，使GRP78(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的主要標(biāo)志分子之一)蛋白表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用Salubrinal(ER應(yīng)激抑制劑)預(yù)處理HL-60細(xì)胞后，結(jié)果表明，通過Salubrinal預(yù)處理可以明顯減少GRP78蛋白的表達(dá)，降低HL-60細(xì)胞的凋亡率。

GRP78是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要標(biāo)志分子，在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起著至關(guān)重要的作用[20]，其在維持腫瘤微環(huán)境穩(wěn)定，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活性、侵襲性和轉(zhuǎn)移性，抵抗抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等有重要作用[21]。本實(shí)驗(yàn)中，沉默GRP78使辣椒素增加的GRP78蛋白表達(dá)下調(diào)；在shGRP78轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞中，由辣椒素觸發(fā)的凋亡也被消除。

綜上所述，辣椒素顯著降低HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活力，促進(jìn)其凋亡。辣椒素觸發(fā)的細(xì)胞凋亡可能取決于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，與調(diào)節(jié)GRP78的表達(dá)有關(guān)。因此，可將辣椒素用作治療AML的可選藥物，為臨床上治療AML提供新的理論依據(jù)。