崔凱潔，邵長(zhǎng)榮，孫雪榮，劉秀香，周繼勇*

0 引言

2019年，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)發(fā)表《中國(guó)大陸李斯特菌病的系統(tǒng)評(píng)價(jià)》一文中指出，中國(guó)大陸李斯特菌病患者人數(shù)可能被嚴(yán)重低估了，圍產(chǎn)期李斯特菌病占李斯特菌總感染的50%以上[1]。妊娠相關(guān)李斯特菌病會(huì)使胎兒和新生兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加約21%[2]。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)可通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)等不良結(jié)局，在存活新生兒中常發(fā)生敗血癥、腦膜炎等嚴(yán)重感染，死亡率高達(dá)20%～46%[1]，是新生兒期死亡的重要原因。新生兒李斯特菌敗血癥具有病情重、合并腦膜炎幾率高、死亡率高等特點(diǎn)，早期識(shí)別并有效治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。本文是膠東半島地區(qū)首個(gè)較大樣本的早發(fā)型新生兒李斯特菌敗血癥的回顧性臨床研究，旨在總結(jié)其臨床特點(diǎn)、抗感染治療和轉(zhuǎn)歸情況，提高臨床醫(yī)生警惕性，及早有效治療。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013年6月至2019年8月青島婦女兒童醫(yī)院收治的早發(fā)型新生兒李斯特菌敗血癥患兒15例?；純壕?003年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組制定的“新生兒敗血癥診療方案”診斷標(biāo)準(zhǔn)，且血培養(yǎng)均為單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性。所有患兒均行腦脊液檢查，符合化膿性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)者10例，其中腦脊液培養(yǎng)李斯特菌陽(yáng)性者5例。15例患兒均為初診病例，男5例、女10例；胎齡≥37周8例、<37周7例；出生體重≥2 500 g 12例、<2 500 g 3例；自然分娩7例、剖宮產(chǎn)8例；均在生后24 h內(nèi)發(fā)病。

1.2 研究方法 對(duì)15例早發(fā)型新生兒李斯特菌敗血癥患兒的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。記錄患兒性別、胎齡、出生體重、生產(chǎn)方式、發(fā)病時(shí)間、主要臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、抗生素選擇種類(lèi)、并發(fā)癥及預(yù)后等。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查 所有患兒入院后24 h內(nèi)行血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、血培養(yǎng)等檢查。在臨床診治過(guò)程中根據(jù)病情均完善腦脊液常規(guī)、生化及培養(yǎng)檢查。

①細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定：在無(wú)菌操作下，取患兒1～2 ml靜脈血和/或1 ml腦脊液，分別注入相應(yīng)培養(yǎng)瓶中，充分搖勻后放入美國(guó)BD公司的細(xì)菌培養(yǎng)儀中檢測(cè)，儀器報(bào)告陽(yáng)性時(shí)轉(zhuǎn)種在血平板、麥康凱瓊脂平板，經(jīng)35 ℃孵箱培養(yǎng)24 h，血瓊脂平板形成1～2 mm半透明灰白色菌落，可見(jiàn)狹窄β-溶血，麥康凱瓊脂平板未見(jiàn)菌群生長(zhǎng)。將新鮮標(biāo)本涂片進(jìn)行革蘭染色見(jiàn)菌體呈革蘭陽(yáng)性短小桿狀菌，成雙排列，動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陽(yáng)性，快速七葉苷水解試驗(yàn)陽(yáng)性，細(xì)菌吲哚試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性。CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性。

②藥敏試驗(yàn)：按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的LM藥敏試驗(yàn)抗生素選擇原則并結(jié)合臨床用藥及研究需要，采用KB藥敏試驗(yàn)。原理：在接種有待測(cè)菌的固體培養(yǎng)基上貼上含藥物的紙片，通過(guò)藥物在培養(yǎng)基上的擴(kuò)散程度，觀察是否有抑菌環(huán)的出現(xiàn)，推斷其是否能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，藥物濃度越低，抑菌能力越強(qiáng)，根據(jù)抑菌環(huán)的大小判定藥物對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)弱。結(jié)果分為敏感、中介和耐藥3級(jí)。

1.2.2 抗生素治療 對(duì)初始給予靜脈用哌拉西林他唑巴坦或第3代頭孢類(lèi)抗生素抗感染的患兒，若腦脊液檢查明顯異常者升級(jí)抗生素為美羅培南和/或萬(wàn)古霉素抗感染，待血或腦脊液培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告后，根據(jù)藥敏試驗(yàn)及病情調(diào)整抗菌藥物。

1.2.3 預(yù)后判定 ①臨床痊愈：敏感抗生素抗感染治療≥2周，連續(xù)2次血培養(yǎng)陰性，血常規(guī)、CRP及PCT均在正常范圍內(nèi)；合并顱內(nèi)感染者，敏感抗生素抗感染治療≥3周，血常規(guī)、CRP及PCT均在正常范圍內(nèi)，連續(xù)2次復(fù)查腦脊液常規(guī)、生化及腦脊液培養(yǎng)、血培養(yǎng)均陰性。②病情好轉(zhuǎn)：使用敏感抗生素未達(dá)療程，或血液、腦脊液復(fù)查結(jié)果未達(dá)到臨床痊愈標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn) 15例早發(fā)型新生兒李斯特菌敗血癥患兒，母親明確產(chǎn)前感染12例，其中發(fā)熱8例(體溫37.6～38.9 ℃)、CRP明顯升高9例(60.4～82.6 mg/L)、PCT明顯升高9例(12.0～90.7 ng/ml)、白細(xì)胞明顯升高8例[(13.61～20.91)×109/L]。此外，母親羊水污染8例(Ⅲ度污染7例、Ⅱ度污染1例)，胎兒宮內(nèi)窘迫7例。15例患兒住院期間的主要臨床表現(xiàn)：發(fā)熱13例(體溫38.2～39.2 ℃)，呼吸困難12例(其中氣管插管7例、NCPAP 1例、鼻導(dǎo)管吸氧4例)，肌張力異常10例(肌張力增高6例、肌張力減低3例、上肢肌張力減低但下肢肌張力增高1例)，反應(yīng)異常(嗜睡或煩躁不安)10例，喂養(yǎng)困難及吃奶差3例，驚厥2例。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 15例李斯特菌敗血癥患兒行血常規(guī)、CRP、PCT、腦脊液、血?dú)夥治?、生化全套及凝血常?guī)等檢查。外周血血常規(guī)白細(xì)胞數(shù)增高8例[(29.88～72.5)×109/L]，白細(xì)胞數(shù)降低3例[(2.7～5.48)×109/L]；CRP明顯升高12例(22.26～>192) mg/L，其中8例>100 mg/L；血小板減低9例(<150×109/L)，其中4例<50×109/L。PCT升高11例[(5.18～80.06) μg/L]。10例患兒腦脊液檢查符合第4版實(shí)用新生兒學(xué)新生兒細(xì)菌性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中白細(xì)胞>5 000×106/L 1例、(1 000～5 000)×106/L 3例、<1 000×106/L 6例，其中腦脊液培養(yǎng)李斯特菌陽(yáng)性5例。在患兒外周血及腦脊液培養(yǎng)中共分離出20株單核細(xì)胞增生李斯特菌(其中外周血15株，腦脊液5株)，體外藥敏試驗(yàn)示患兒對(duì)哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、紅霉素、美羅培南、萬(wàn)古霉素等敏感率均為100.0%；對(duì)氨芐西林、青霉素、苯唑西林敏感率分別為25.0%、30.0%、45.0%。20株血和/或腦脊液培養(yǎng)LM的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 20株單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)10種常用抗生素藥物的敏感性

2.3 頭顱影像學(xué)檢查 15例患兒中，12例完善頭顱影像學(xué)檢查：9例異常，3例正常；具體頭顱影像學(xué)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 15例早發(fā)型李斯特菌敗血癥患兒抗生素應(yīng)用、影像學(xué)及轉(zhuǎn)歸

2.4 治療和預(yù)后 10例患兒初始治療即選用美羅培南，其中6例患兒同時(shí)聯(lián)合萬(wàn)古霉素；3例患兒首選頭孢類(lèi)抗生素，待腦脊液檢查確診腦膜炎后升級(jí)抗生素為美羅培南或萬(wàn)古霉素；1例患兒住院期間僅使用哌拉西林他唑巴坦治療。11例患兒治愈出院，2例患兒好轉(zhuǎn)出院，1例患兒因腦積水加重轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院治療，1例患兒放棄治療后死亡。

2.5 隨訪 除去1例放棄治療死亡患兒，對(duì)14例患兒進(jìn)行電話(huà)隨訪，隨訪時(shí)間2019年10月2日，患兒年齡1～6歲，除病例9因腦積水行腦脊液分流術(shù)后現(xiàn)走路姿勢(shì)跛行外，其余患兒均一般情況良好。

3 討論

LM是革蘭陽(yáng)性短小桿菌，隸屬于李斯特菌屬，廣泛存在于自然環(huán)境中，主要傳播途徑為食物傳播、母嬰垂直傳播和水平傳播[3]。LM是一種條件致病菌，其需氧或兼性厭氧，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，可產(chǎn)生一種溶血性外毒素，對(duì)人類(lèi)致病性強(qiáng)。主要易感人群為孕產(chǎn)婦、老年人及免疫功能低下者。妊娠期婦女感染李斯特菌病可導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)以及嚴(yán)重的新生兒感染。

在15例患兒母親中，12例有明確產(chǎn)前感染病史，其中產(chǎn)前有發(fā)熱病史者8例、有CRP明顯升高者9例，提示LM導(dǎo)致的圍生期宮內(nèi)感染常出現(xiàn)發(fā)熱、CRP明顯升高。此外，15例患兒母親中8例伴有羊水污染、7例伴有胎兒宮內(nèi)窘迫。因此，在患兒母親出現(xiàn)發(fā)熱、CRP明顯升高、羊水污染、胎兒宮內(nèi)窘迫時(shí)，應(yīng)警惕妊娠期LM感染。15例患兒發(fā)病年齡均在生后24 h內(nèi)，符合早發(fā)型新生兒敗血癥國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)即生后72 h內(nèi)發(fā)生的敗血癥，提示其感染為母嬰垂直傳播的宮內(nèi)感染，該結(jié)果與張鶯等[4]報(bào)道一致。

從15例李斯特菌敗血癥患兒臨床資料分析，主要臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、呼吸困難、肌張力異常、反應(yīng)差、黃疸、吃奶差和驚厥等。這些癥狀均為新生兒敗血癥的共有癥狀，缺乏特異性，僅憑臨床表現(xiàn)難以判斷病原體，給臨床醫(yī)生早期針對(duì)性治療帶來(lái)困難。目前新生兒敗血癥診治的基本原則是根據(jù)臨床表現(xiàn)、高危因素、實(shí)驗(yàn)室檢查綜合判斷[5]，而不僅僅依賴(lài)血培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果。然而，在病原學(xué)診斷方面，血培養(yǎng)仍是主要方法，但該方法陽(yáng)性率低，且耗時(shí)長(zhǎng)，易延誤診治。鑒于早發(fā)型新生兒李斯特菌敗血癥進(jìn)展快、死亡率高，加之LM對(duì)頭孢類(lèi)抗生素天然耐藥、臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥不能覆蓋等特點(diǎn)，臨床診治不能完全依靠細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，應(yīng)積極尋找其他病原學(xué)檢查途徑。在特異性診斷方面，針對(duì)病原菌的分子生物學(xué)診斷、聚合酶鏈反應(yīng)和其他基于基因的檢測(cè)技術(shù)(如細(xì)菌DNA測(cè)序)已應(yīng)用于臨床檢測(cè)微生物，具有檢測(cè)快速、敏感性高的明顯優(yōu)勢(shì)[6-7]。然而，該檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)醫(yī)院中并未廣泛展開(kāi)。鑒于此，在臨床工作中若新生兒早發(fā)型血流感染高度懷疑LM感染時(shí)，有條件的醫(yī)院可以做細(xì)菌共有的基因片段(16SrRNA基因)擴(kuò)增，檢測(cè)血液中存在的細(xì)菌核酸以早期確診，而在大多數(shù)尚未開(kāi)展該項(xiàng)技術(shù)的醫(yī)院，可在經(jīng)驗(yàn)性選用抗生素時(shí)，提高對(duì)早發(fā)型新生兒LM病的警惕性，選擇能夠覆蓋LM的抗生素。

15例確診敗血癥患兒均常規(guī)行腰椎穿刺完善腦脊液檢查，其中有10例患兒腦脊液檢查符合《實(shí)用新生兒學(xué)化膿性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》)(第4版)[8]，占本次研究病例的67%。該數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般新生兒敗血癥并發(fā)化膿性腦膜炎的幾率(25%)[8]。因其合并腦膜炎幾率比一般新生兒敗血癥明顯升高，考慮到細(xì)菌性腦膜炎有遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)早發(fā)型李斯特菌敗血癥患兒早期識(shí)別有無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)感染顯得尤為重要。由于病程早期抗生素的使用，常常導(dǎo)致腦脊液特征改變不典型、病原學(xué)培養(yǎng)陽(yáng)性率低，給腦膜炎的診斷帶來(lái)困難且有遺漏診斷的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，在腦膜炎診斷方面，越來(lái)越多的診斷標(biāo)志物和檢測(cè)技術(shù)被提出，如C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、腦脊液乳酸及有關(guān)免疫層析法、聚合酶鏈反應(yīng)、二代測(cè)序等，有希望為早期診斷細(xì)菌性腦膜炎提供參考依據(jù)[9]。Trippella等[10]提出，當(dāng)血清PCT>2.0 μg/L時(shí)，診斷細(xì)菌性腦膜炎的可能性非常大，但血清PCT<0.5 μg/L時(shí)，尚不能除外細(xì)菌性腦膜炎。目前國(guó)內(nèi)已有學(xué)者提出，腦脊液病原二代測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)腦脊液中的LM，同時(shí)不受限于采樣時(shí)間以及抗菌藥物的應(yīng)用，有利于及時(shí)診治[11-12]。但由于測(cè)序成本高，樣本本身的復(fù)雜多樣性及后序分析所需的人為經(jīng)驗(yàn)，該技術(shù)常規(guī)應(yīng)用于臨床受到限制[13]。

LM對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗生素天然耐藥，這是由于LM的細(xì)胞膜至少存在5種青霉素結(jié)合蛋白，這些蛋白不能與頭孢菌素類(lèi)抗生素結(jié)合，可與阿莫西林結(jié)合，因此藥敏試驗(yàn)不包含頭孢類(lèi)抗生素。本研究15份血標(biāo)本和5份腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性，共分離出20株LM。20株LM體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，LM對(duì)哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、紅霉素、美羅培南、萬(wàn)古霉素等均敏感；對(duì)氨芐西林、青霉素、苯唑西林敏感率分別為25%、30%、45%。藥敏結(jié)果與蔣琦、楊梅等[14-15]報(bào)道一致，即LM對(duì)青霉素、苯唑西林、氨芐西林等單制劑青霉素類(lèi)抗生素出現(xiàn)部分耐受，而哌拉西林他唑巴坦等青霉素復(fù)合制劑對(duì)LM有較高的敏感性，因此，哌拉西林他唑巴坦可能成為新一代新生兒LM感染的首選藥物[15]。由于新生兒尤其是早產(chǎn)兒免疫功能不成熟，且近年來(lái)宮內(nèi)感染發(fā)生率逐年攀升，抗生素在NICU的應(yīng)用非常廣泛且力度較大，隨之而來(lái)的便是細(xì)菌耐藥性逐漸產(chǎn)生，且從單一耐藥向多重耐藥發(fā)展，因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)LM耐藥性的檢測(cè)，合理應(yīng)用抗生素，降低耐藥菌株出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。目前雖尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道哌拉西林他唑巴坦等酶抑制劑對(duì)LM耐藥相關(guān)性的研究，但酶抑制劑對(duì)LM耐藥性變遷的影響不除外，在臨床工作中應(yīng)引起重視。本研究中11例患兒治愈出院，2例好轉(zhuǎn)出院，治愈率高，可能與本院NICU醫(yī)師對(duì)新生兒LM感染有較高的警惕性以及入院后首選美平或聯(lián)合萬(wàn)古霉素的強(qiáng)力抗感染有關(guān)，因此,對(duì)于病情危重LM感染患兒，或者可疑及確診存在顱內(nèi)感染時(shí),可考慮選用美羅培南提高臨床治愈率。

綜上，我國(guó)李斯特菌病病例數(shù)可能被嚴(yán)重低估，妊娠期婦女對(duì)李斯特菌病明顯易感，孕婦圍生期感染所致的早發(fā)型新生兒李斯特菌敗血癥具有病情重、合并腦膜炎幾率高等特點(diǎn)。因此，建議開(kāi)展針對(duì)妊娠L(fēng)M的篩查，并呼吁針對(duì)圍生期新生兒李斯特菌敗血癥的專(zhuān)家共識(shí)或診療指南盡快出爐，為新生兒李斯特菌敗血癥的早期有效規(guī)范治療提供保障。在此之前，本文建議針對(duì)患兒母親有發(fā)熱、CRP明顯升高、胎兒宮內(nèi)窘迫、羊水污染，且患兒生后有發(fā)熱、呼吸困難、肌張力異常、反應(yīng)差、黃疸、吃奶差和驚厥等臨床表現(xiàn)者，新生兒科醫(yī)生應(yīng)高度警惕LM感染，在經(jīng)驗(yàn)性選用抗生素時(shí)，可選用哌拉西林他唑巴坦等能夠覆蓋李斯特菌的廣譜抗生素。對(duì)于高度懷疑及確診LM腦膜炎患兒可首選美羅培南。