袁江月 何 佳 孫軍杰 芮 蓬 劉錫銘

(1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

紫薯屬于旋花科一年生草本植物，是薯肉顏色為紫色的甘薯，含有豐富的花青素類色素[1]。花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于類黃酮化合物，也是植物的主要呈色物質(zhì)。自然條件下，游離的花青素常與一個或多個葡萄糖、槐糖和阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色苷，而花色苷中的糖苷基和羥基還可以與一個或幾個分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和對羥基苯甲酸等通過酯鍵形成酰基化的花色苷[2]。因此，紫薯可有效清除人體自由基以起到抗衰老的作用[3]。

張毅等[4]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種紫薯花色苷含量與組分各不相同且紫薯花色苷均以?；男问酱嬖?。朱璐等[5]綜合評價了浸提法、微波輔助法和超聲波輔助法提取的紫薯花色苷的抗氧化活性。Gras等[6]通過在紫薯花色苷中加入氯原酸和玫瑰酸，以及不同劑量的食品級酚類蘋果和迷迭香提取物，研究了分子間共色素的定量和定性影響。

目前，常見的花色苷提取方法主要有溶劑提取法、酸性溶劑萃取法、超臨界流體法、微波提取法、酶提取法和微生物發(fā)酵提取法等[7]。而釀造紫薯酒是一種能夠較好地提取、利用紫薯花色苷的方法，是酸性溶劑萃取法、酶提取法和微生物發(fā)酵提取法的有機結(jié)合。但花色苷同時存在易氧化、易分解的特點[8]，紫薯酒釀造過程中可能會導致花色苷分解。李甜等[9]研究了紫薯酒發(fā)酵過程與顏色相關(guān)的花色苷含量、褐變指數(shù)、聚合色度和總色度變化規(guī)律及其相關(guān)性等。郭孝萱等[10]研究了黑曲霉、米根霉和米曲霉3種絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵對紫薯中花色苷含量的影響。而有關(guān)紫薯花色苷種類與含量在紫薯酒釀造過程中的變化尚未見報道。文章擬采用UPLC-MS/MS法測定紫薯酒釀造過程中花色苷含量的變化，并對不同階段樣品中的花色苷進行定性與定量分析，旨在為紫薯花色苷的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：群紫1號，市售；

鹽酸：分析純，洛陽昊華化學試劑有限公司；

檸檬酸：分析純，錦州市向陽化學試劑廠；

釀酒酵母：黃酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；

AB-8大孔吸附樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；

甲醇、甲酸：色譜純，天津市德恩化學試劑有限公司；

果膠酶(≥ 40 U/mg)、淀粉酶(約 4×104U/g)、糖化酶(約1×105U/g)：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250型，北京市永光明醫(yī)療儀器公司；

冷凍離心機：TGL-16M型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；

分光光度計：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

超聲清洗儀：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52-86A型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：YP602N型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

酸度計：PHS-25型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS50SII型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

超高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters H-Class TQ-S Micro型，沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 紫薯花色苷濃縮液制備 根據(jù)文獻[11]修改如下：將100 g生紫薯和經(jīng)高溫蒸煮的100 g熟紫薯(蒸鍋中上汽后再蒸煮20 min至完全熟透)分別與酸化乙醇(V1.5 mol/L HCl∶V95%乙醇=15∶85)按m紫薯∶V酸化乙醇=l∶12(g/mL)打漿，60 ℃超聲浸提40 min，4層尼龍紗布過濾，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，蒸餾水沖洗除去糖、無機鹽等雜質(zhì)，用80%乙醇于25 ℃、100 r/min搖床中洗脫1 h，重復3次，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得花色苷濃縮液，定容至50 mL。

1.3.2 紫薯酒花色苷濃縮液制備 根據(jù)文獻[12]修改如下：將熟紫薯清洗去皮并挑選100 g，按m紫薯∶m蒸餾水=1∶1 加水打漿10 min，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至6.5，加入0.1% 淀粉酶液化，90 ℃水浴90 min；液化后降溫至60 ℃，調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.1%糖化酶糖化，60 ℃水浴80 min；糖化后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至6.0，將黃酒專用酵母接種至制備好的紫薯漿液中，接種量0.3%，活化水溫35～38 ℃，活化15 min后，將水溫降至30～32 ℃，于26 ℃發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束后處理同1.3.1。

1.4 指標測定

1.4.1 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用測定條件

(1)色譜條件：根據(jù)文獻[13]并修改。色譜柱為Waters BEH Cl8柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，進樣體積2 μL，柱溫25 ℃，流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動B為100%甲醇；梯度洗脫條件：0～10 min，95%～70% A；10～25 min，70%～65% A；25～30 min，10% A；30～32 min，95% A；32～35 min，95% A。流速0.1 mL/min。

(2)質(zhì)譜條件：根據(jù)文獻[14]并修改。掃描模式ES+；掃描范圍700～1 200(m/z)；掃描時間0.5 s；毛細管電壓3 000 V；錐孔電壓20 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃，流量1 000 L/h；錐孔反吹氣流量50 L/h；二級質(zhì)譜碰撞能量25 V；離子掃描范圍200～1 200(m/z)，正離子模式。

1.4.2 花色苷定性及定量方法

(1)定性方法：結(jié)合相對保留時間、一級質(zhì)譜分子離子和二級質(zhì)譜碎片離子，推測花色苷種類。

(2)定量方法：采用峰面積法。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 使用MassLynx?軟件得到色譜圖數(shù)據(jù)點及各花色苷峰面積積分，使用Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷種類

2.1.1 花色苷總離子流圖 圖1為不同處理階段紫薯花色苷濃縮液的總離子流圖。

A.生紫薯 B.熟紫薯 C.紫薯酒

2.1.2 花色苷的鑒定 通過樣品一級質(zhì)譜確認，蒸煮和發(fā)酵前后樣品中均含有m/z為893，907，935，949，1 069，1 097，1 111，1 125的花色苷，分別以組分1，2，3，4，5，6，7，8命名，并通過對各組分一級質(zhì)譜的分子離子和二級質(zhì)譜的碎片離子進行分析，推斷花色苷的種類。

由圖3、圖4可知，組分1的保留時間為12.25 min，其分子離子m/z893二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z287，449，731，與Tian等[15]的結(jié)論相同，因此m/z287可以認定為矢車菊素；m/z449可以認定為失去一分子槐糖和一分子對羥基苯甲酸[M-324-120]+得到的碎片；m/z731可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分1可以認定為矢車菊素3-對羥基苯甲?；碧擒?5-葡糖苷。

圖2 生紫薯花色苷出峰時間分布圖

圖3 組分1一級質(zhì)譜圖

圖4 組分1二級質(zhì)譜圖

由圖5、圖6可知，組分2的保留時間為13.77 min，其分子離子m/z907二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z301，463，745，與Tian等[15]的結(jié)論相同，因此m/z301可以認定為芍藥素；m/z463可以認定為失去一分子槐糖和一分子對羥基苯甲酸[M-324-120]+得到的碎片；m/z745可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分2可以認定為芍藥素3-對羥基苯甲?；碧擒?5-葡糖苷。

圖6 組分2二級質(zhì)譜圖

由圖7、圖8可知，組分3的保留時間為16.37 min，其分子離子m/z935二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z287，449，773，與Suda等[16]的結(jié)論相同，因此m/z287可以認定為矢車菊素；m/z449可以認定為失去一分子槐糖和一分子咖啡酸[M-324-162]+得到的碎片；m/z773可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分3可以認定為矢車菊素3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷。

圖7 組分3一級質(zhì)譜圖

圖8 組分3二級質(zhì)譜圖

由圖9、圖10可知，組分4的保留時間為18.31 min，其分子離子m/z949二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z301，463，787，與Tian等[15]的結(jié)論相同，因此m/z301可以認定為芍藥素；m/z463可以認定為失去一分子槐糖和一分子咖啡酸[M-324-162]+得到的碎片；m/z787可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分4可以認定為芍藥素3-咖啡?；碧擒?5-葡糖苷。

圖9 組分4一級質(zhì)譜圖

圖10 組分4二級質(zhì)譜圖

由圖11、圖12可知，組分5的保留時間為22.11 min，其分子離子m/z1 069二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z301，463，907，與Islam等[17]的結(jié)論相同，因此m/z301可以認定為芍藥素；m/z463可以認定為失去一分子槐糖、一分子咖啡酸和一分子對羥基苯甲酸[M-324-162-120]+得到的碎片；m/z907可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分5可以認定為芍藥素3-咖啡酰-對羥基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷。

圖11 組分5一級質(zhì)譜圖

圖12 組分5二級質(zhì)譜圖

由圖13、圖14可知，組分6的保留時間為17.76 min，其分子離子m/z1 097二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z287，449，935，與Tian等[15]的結(jié)論相同，因此m/z287可以認定為矢車菊素；m/z449可以認定為失去一分子槐糖和兩分子咖啡酸[M-324-162×2]+得到的碎片；m/z935可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分6可以認定為矢車菊素3-(6″，6?-雙咖啡?；碧擒?-5-葡糖苷。

圖13 組分6一級質(zhì)譜圖

圖14 組分6二級質(zhì)譜圖

由圖15、圖16可知，組分7的保留時間為20.87 min，其分子離子m/z1 111二級質(zhì)譜有3個碎片離子，分別為m/z287，449，949，與Suda等[16]的結(jié)論相同，因此m/z287可以認定為矢車菊素；m/z449可以認定為失去一分子槐糖、一分子阿魏酸和一分子咖啡酸[M-324-176-162]+得到的碎片；m/z949可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分7可以認定為矢車菊素3-(6″-咖啡酰-6?-阿魏酰槐苷)-5-葡糖苷。

圖15 組分7一級質(zhì)譜圖

圖16 組分7二級質(zhì)譜圖

由圖17、圖18可知，組分8的保留時間為25.15 min，其分子離子m/z1 125有3個碎片離子，分別為m/z301，463，963，與Suda等[16]的結(jié)論相同，因此m/z301可以認定為芍藥素；m/z463可以認定為失去一分子槐糖、一分子阿魏酸和一分子咖啡酸[M-324-176-162]+得到的碎片；m/z963可以認定為失去一分子葡萄糖[M-162]+得到的碎片。組分8可以認定為芍藥素3-(6″-咖啡酰-6?-阿魏?；避?-5-葡糖苷。

圖17 組分8一級質(zhì)譜圖

圖18 組分8二級質(zhì)譜圖

由表1可知，在?；鶊F和糖基相同或類似的情況下，矢車菊素花色苷的保留時間小于芍藥素花色苷的，與Truong等[18]的結(jié)果一致，符合花色苷在UPLC圖譜中的分配規(guī)律。此外，Tian等[15-17]還檢測出了m/z773矢車菊素3-槐糖苷-5-葡糖苷等多種花色苷，而試驗未檢測到，可能與品種、產(chǎn)地等差異有關(guān)[4]。

表1 花色苷指認匯總表

2.2 花色苷含量變化

由圖19可知，紫薯發(fā)酵為紫薯酒后有8種花色苷發(fā)生了變化，組分1矢車菊素3-對羥基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷最終得率為33%；組分2芍藥素3-對羥基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷最終得率為31%；組分3矢車菊素3-咖啡?；碧擒?5-葡糖苷最終得率為31%；組分4芍藥素3-咖啡?；碧擒?5-葡糖苷最終得率為45%；組分5芍藥素3-咖啡酰-對羥基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷最終得率為28%；組分6矢車菊素3-(6″，6?-雙咖啡?；碧擒?-5-葡糖苷最終得率為26%；組分7矢車菊素3-(6″-咖啡酰-6?-阿魏?；碧擒?-5-葡糖苷最終得率為28%；組分8芍藥素3-(6″-咖啡酰-6?-阿魏?；碧擒?-5-葡糖苷最終得率為28%。

由圖19還可知，經(jīng)高溫蒸煮工藝，紫薯中花色苷種類未發(fā)生變化，但花色苷含量減少，可能是部分花色苷受熱分解。其中減少得最多的為組分4芍藥素3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷，表明其熱穩(wěn)定性較差；減少得最少的為組分3矢車菊素3-咖啡?；碧擒?5-葡糖苷，表明其熱穩(wěn)定性較好。劉海英等[19]研究表明，紫薯花色苷的熱降解符合一級反應動力學模型，隨著溫度的升高，紫薯花色苷降解速率明顯加快。此外，蒸煮后部分花色苷提取率有所升高，具體原因有待進一步研究。紫薯發(fā)酵為紫薯酒后，8種花色苷得率約為總量的30%，與梁敏等[20]的結(jié)果相近。發(fā)酵后紫薯酒中提取量最多的花色苷為組分4芍藥素3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷，提取量最少的為組分6矢車菊素3-(6″，6?-雙咖啡酰槐糖苷)-5-葡糖苷。

圖19 花色苷峰面積變化趨勢圖

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法對紫薯酒發(fā)酵前后的花色苷種類及含量進行了分析。結(jié)果表明：紫薯酒中共鑒定出8種花色苷，高溫蒸煮會使部分花色苷受熱分解，而釀造紫薯酒可以有效從紫薯中提取花色苷；經(jīng)高溫蒸煮和7 d發(fā)酵后，8種花色苷最終得率為26%～45%。此外，發(fā)酵后花色苷未完全提取，這可能與浸提時間不足、花色苷易分解以及酵母菌的吸附作用等因素有關(guān)，具體原因有待進一步研究。