李雨虹，耿鵬，劉建民，時祎，辛瑜，石貴陽，張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 3(山東惠仕萊生物科技有限公司，山東 濟南，250101)

鈣二醇鈣二醇(25-hydroxy vitamin D3, 25-OH VD3)是VD3的羥基化衍生物[1]，其制劑產(chǎn)品在臨床上主要對慢性腎臟疾病、高血糖癥、膽汁淤積性肝病有預防作用，并且可以治療老年骨質(zhì)疏松癥，因此有較好的發(fā)展前景[2-4]。25-OH VD3的制備方法主要有化學合成法及微生物轉(zhuǎn)化法，微生物轉(zhuǎn)化法因其高選擇性、作用溫和等優(yōu)點，引起了諸多學者的關(guān)注[5-6]。在微生物中，一般通過VD3羥化酶(VD3hydroxylase，Vdh)對VD3進行羥基化，使無生物活性的脂溶性激素原VD3轉(zhuǎn)化25-OH VD3，進而發(fā)揮其生物活性[7-9]。

Vdh基因最初發(fā)現(xiàn)于一種稀有的放線菌-自養(yǎng)無支梭菌(Pseudonocardiaautotrophica)中，該菌株具備將VD3羥化為25-OH VD3的能力[10-11]。KANG等[12]利用Pseudonocardiasp.KCTC 1029BP的細胞作為全細胞催化劑轉(zhuǎn)化VD3，成功制備出61.87 mg/L的25-OH VD3，但是由于野生菌轉(zhuǎn)化時間長達9 d，且產(chǎn)物種類眾多，不利于后續(xù)分離純化。ABDULMUGHNI等[13]采用基因工程的方法異源表達Vdh，在巨大芽孢桿菌MS941中使用牛腎上腺毒素還原酶和腎上腺毒素體外系統(tǒng)建立了轉(zhuǎn)化VD3的方法，雖然這種方法有效的降低了轉(zhuǎn)化時間，但巨大芽孢桿菌作為宿主菌的安全問題有待進一步探討。

本研究選擇枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為VD3羥化酶的宿主，其屬于食品級安全微生物(generally recognized as safe，GRAS)[14]，而且生長條件簡單，易于培養(yǎng)，周期短，便于工業(yè)上大規(guī)模的高密度發(fā)酵應用生產(chǎn)，廣泛應用于食品及醫(yī)藥等領域[15]。本工作首先構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600/pMA5-vdh，采用CO差光譜法對表達后的酶進行酶活力檢測。進一步利用枯草芽孢桿菌全細胞催化系統(tǒng)合成25-OH VD3，并對其進行鑒定。該方法創(chuàng)新性地將枯草芽孢桿菌全細胞催化系統(tǒng)應用于25-OH VD3的合成，同時優(yōu)化全細胞轉(zhuǎn)化的條件，提高了25-OH VD3的轉(zhuǎn)化率，這為合成安全的25-OH VD3提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VD3、25-OH VD3，阿拉丁(上海)有限公司；連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、溶菌酶、乙酸乙酯、乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶(NdeⅠ，MluⅠ)、T4DNA連接酶，美國Thermo Fisher公司；2×TaqPCR MasterMix、2×PfuPCR MasterMix，杭州寶賽公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，康寧生命科學有限公司(上海)；卡那霉素、氨芐青霉素，美國Sigma公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，英國OXOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

VD3溶液配方：先用乙醇溶液溶解，再用滅過菌的0.22 μm的有機膜進行過濾，加入2-羥丙基-β-環(huán)糊精用作助溶劑，2-羥丙基-β-環(huán)糊精因其特有的空腔結(jié)構(gòu)能夠把VD3包裹在內(nèi)，使其在發(fā)酵液中達到完全溶解。

1.2 儀器與設備

A-5082酶標儀，TECAN公司；525BR蛋白電泳儀，美國Bio Rad公司；UV 1800PC紫外可見分光光度計，上海美普達有限公司；JY92-IIDN超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；Seven Multi pH計，梅特勒托利多儀器有限公司；Chromaster高效液相色譜儀，日立公司；ZORBAX SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 3.5-Micron)，美國安捷倫公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國沃符世公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種、質(zhì)粒、以及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis168、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600、大腸桿菌Escherichia.coliJM109與質(zhì)粒pMA5為本實驗室保藏；Vdh(GenBank：BAH58688.1)、啟動子bacteriophage SPO1 promoter由上海生工合成。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。

1.3.2 重組質(zhì)粒CYP107的構(gòu)建

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得Vdh(GenBank:BAH58688.1)的基因序列，按照枯草芽孢桿菌密碼子偏愛性進行優(yōu)化合成基因，以其為模板，使用正向引物(CGCCATATGATGGCTTTAACAACTACTGGT)和反向引物(CGACGCGTTTAAGCAGAACGTGGACCCAT)擴增基因序列，引物的兩端引入酶切位點NdeⅠ/MluⅠ。通過上述酶切位點連入pMA5中，并轉(zhuǎn)化入E.coliJM109感受態(tài)細胞。挑取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600細胞中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行保藏，獲得重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600/pMA5-vdh。

1.3.3 Vdh在枯草芽孢桿菌中進行表達

挑取卡那霉素的LB抗性平板上的重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600/pMA5-vdh于15 mL、含有卡那霉素(30 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。取上述菌液以2%(體積分數(shù))轉(zhuǎn)接至250 mL錐形瓶中的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在OD600為0.6時通過添加0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導蛋白表達。37 ℃培養(yǎng)24 h后離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)收集細胞并洗滌。使用50 mg溶菌酶在37 ℃靜置0.5 h，并使用超聲細胞破碎儀在40%的功率下進行超聲處理(破碎3 s暫停2 s，工作9 min)。最后通過離心取上清液并進行SDS-PAGE分析，評估目標蛋白的表達性能。

1.3.4 酶活力檢測

Vdh屬于典型的細胞色素P450酶，是一類含有B型血紅素的蛋白超家族[16-18]，其還原態(tài)可以和CO結(jié)合并在450 nm處產(chǎn)生特征吸收峰[19]。根據(jù)CO差光譜法檢測酶活力[20]，將待測樣品用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.4)稀釋至蛋白質(zhì)量濃度約為0.3 g/L，取2 mL樣品加入連二亞硫酸鈉10 mg，立即混勻，反應5 min后，等量分裝到2個離心管中，分別作為對照組和樣本組。向樣本組緩慢通入CO 2 min，蓋緊蓋子，穩(wěn)定10 min，取200 μL加入96孔板中，用酶標儀進行400～500 nm全波長掃描。并根據(jù)公式(1)計算P450酶的含量：

(1)

式中：摩爾吸光系數(shù)ε=91 L/(mmol·cm)，P為蛋白質(zhì)量濃度，g/L。

1.3.5 全細胞轉(zhuǎn)化

取1 mL種子液接種于50 mL初級轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后加入22.5 g/L的2-羥丙基-β-環(huán)糊精、18 g/L的葡萄糖溶液，再加入終質(zhì)量濃度為0.1 g/L的底物VD3，30 ℃、200 r/min 繼續(xù)轉(zhuǎn)化24 h后4 ℃、10 000 r/min離心10 min得到菌體，菌體用PBS緩沖液洗滌過后，加入0.1 mmol/L的PBS以及溶菌酶37 ℃放置0.5 h，在超聲破碎儀下進行破碎，破碎液4 ℃、10 000 r/min離心10 min取上清液與乙酸乙酯按1∶1的體積比混合均勻，4 ℃、10 000 r/min離心5 min后取上層有機相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，濃縮至得到白色粉末，用甲醇溶解后進行HPLC檢測。相同條件以等菌體濃度的pMA5菌株單獨轉(zhuǎn)化為對照。

1.3.6 產(chǎn)物檢測與鑒定

將溶解好的樣品用0.22 μm的有機膜過濾后，在WATERS ACQUITY UPLC色譜儀上使用BEH C18(2.1 mm×150 mm, 1.7 μm)分析柱對樣品進行分析，流動相由80%(體積分數(shù))的乙腈水溶液組成。在265 nm處檢測底物，以WATERS ACQUITY PDA為檢測器，柱溫為45 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

為進一步確定產(chǎn)物的分子質(zhì)量，利用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時問質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國沃符世公司)獲取樣品的質(zhì)譜圖。采用MassLynx V4.1(Waters, USA)對原始數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.7 全細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)酵條件的優(yōu)化

在初始轉(zhuǎn)化條件為接種量2%，接種后 12 h 加底物質(zhì)量濃度為0.1 g/L的VD3，以及18 g/L的葡萄糖和22.5 g/L的2-羥丙基-β-環(huán)糊精基礎上，通過單因素試驗分別考察轉(zhuǎn)化溫度(26～34 ℃)、初始pH(pH 5.0～9.0)、發(fā)酵時間、搖床轉(zhuǎn)速(160～240 r/min)對轉(zhuǎn)化率的影響。利用單因素實驗優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化溫度、初始pH、發(fā)酵時間以及搖床轉(zhuǎn)速篩選到的條件進行底物轉(zhuǎn)化，確定最高轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vdh基因Vdh的克隆與表達

如圖1所示，構(gòu)建質(zhì)粒pMA5-Vdh。首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到Vdh的序列，長度為1 212 bp，合成該序列并作為模板，進行PCR擴增，電泳結(jié)果如圖2-a所示，可見特異性條帶位置與目標基本一致。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-vdh重組質(zhì)粒的大小為8 398 bp；將重組質(zhì)粒分別用NdeⅠ、MluⅠ雙酶切。pMA5-vdh酶切后理論條帶大小是1 212和7 186 bp，結(jié)果如圖2-b所示，電泳條帶大小與理論值一致，說明Vdh基因成功插入了表達載體pMA5中，PCR也驗證了pMA5-vdh構(gòu)建的成功。按照方法1.3.3 表達該重組菌，細胞破碎后，SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3，重組菌裂解物上清液在約46 kDa位置表達有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶，與目標分子質(zhì)量一致，表明基因Vdh在枯草芽孢桿菌中成功表達。

圖1 質(zhì)粒pMA5-vdh圖譜Fig.1 Construction map of plasmid pMA5-vdh

M-DNA marker a-Vdh基因擴增結(jié)果；b-重組質(zhì)粒酶切鑒定圖2 目的基因及重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳結(jié)果Fig.2 Results for agarose gel electrophoresis of target genes and recombination vectors

M-標準蛋白marker；1-B.subtilis WB600/pMA5粗酶液； 2-重組菌B.subtilis WB600/pMA5-vdh粗酶液圖3 重組酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE result of recombination enzyme

2.2 酶的表達與酶活力檢測

作為P450超家族成員，Vdh自身含有的亞鐵紅素輔基可以與CO結(jié)合而在450 nm處呈現(xiàn)特殊的光譜吸收峰。根據(jù)此原理，對樣品進行光譜分析，如圖4所示，在420 nm處樣品峰值升高，此吸收峰為亞鐵紅素的低自旋狀態(tài)所導致，加入強還原劑連二亞硫酸鈉后，亞鐵血紅素基團被還原，從而降低其在420 nm處的吸收峰。樣品通入CO后，還原型的Vdh與CO結(jié)合并在450 nm處呈現(xiàn)特征吸收峰，從而證實Vdh在本體系中實現(xiàn)活性表達。根據(jù)公式(1)計算得，羥基化酶含量為0.56 nmol/g。

圖4 Vdh的酶活力測定Fig.4 Determination of Vdh enzyme activity

2.3 產(chǎn)物的檢測與鑒定

通過Vdh對VD3進行羥基化，可以將底物VD3轉(zhuǎn)化產(chǎn)物25-OH VD3。根據(jù)1.3.6所示方法檢測底物及產(chǎn)物出峰，如圖5所示，在5.29 min親水性更強的產(chǎn)物洗脫下來，7.58 min底物VD3被洗脫下來，因產(chǎn)物與標樣25-OH VD3的出峰時間一致，初步判斷其為25-OH VD3。

圖5 標樣(VD3、25-OH VD3)和樣品的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of standard(VD3、25-OH VD3) and sample

進一步使用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時問質(zhì)譜聯(lián)用儀分析樣品，目標分析物在ESI+條件下形成[M+H]+的準分子離子峰，產(chǎn)生m/z約401的特征離子碎片，同時產(chǎn)生脫去1個水分子的[M+H-H2O]+碎片離子和脫去2個水分子的[M+H-2H2O]+碎片離子。圖6中的準分子離子峰[M+H]+為m/z401，因此可以確定其相對分子質(zhì)量為400，與25-OH VD3標樣產(chǎn)生的準分子離子峰一致，因此進一步確認VD3可被轉(zhuǎn)化為25-OH VD3。

圖6 25-OH VD3的ESI+質(zhì)譜圖Fig.6 ESI+mass spectrum of 25-OH VD3

2.4 全細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。不同發(fā)酵溫度會影響產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，如圖7-a所示，隨著溫度的升高，細胞的生長繁殖加快，細胞內(nèi)產(chǎn)生的酶隨之增多，因此轉(zhuǎn)化率隨之升高，在30 ℃達到最高，之后隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)化率逐漸降低，因此選擇30 ℃為轉(zhuǎn)化最適溫度。

2.4.2 初始pH對轉(zhuǎn)化率的影響

控制一定的pH是保證微生物生長的主要條件之一，pH可使細胞的代謝通路和細胞膜的通透性發(fā)生改變，從而影響菌體生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物的合成。不同微生物對pH的要求各不相同，因此，選擇合適的pH對微生物發(fā)酵具有重要意義。如圖7-b所示，25-OH VD3的最佳初始pH為7.0，此時轉(zhuǎn)化率達到最高。

2.4.3 發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化率的影響

發(fā)酵時間對產(chǎn)物合成的影響也十分顯著，因為隨著發(fā)酵時間的延長，菌體的狀態(tài)、培養(yǎng)基組分、pH等都會發(fā)生變化，因此，對發(fā)酵時間進行優(yōu)化十分必要。如圖7-c所示，25-OH VD3在轉(zhuǎn)化48 h后產(chǎn)率達到最高值，培養(yǎng)時間過長反而導致菌體的自溶，所以確定25-OH VD3的轉(zhuǎn)化時間為48 h。

2.4.4 搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化率的影響

搖床轉(zhuǎn)速主要通過溶氧量來影響發(fā)酵，轉(zhuǎn)速較慢時，發(fā)酵液中的溶氧量少，不利于細菌發(fā)酵，如果過快則對細菌損傷大，也不利于發(fā)酵。如圖7-d所示，從160 r/min開始，隨著轉(zhuǎn)速的升高，轉(zhuǎn)化率逐漸升高，到220 r/min時轉(zhuǎn)化率達到最高，之后過高的轉(zhuǎn)速反而使轉(zhuǎn)化率下降。

3 結(jié)論與討論

VD類藥物中的鈣二醇(25-OH VD3)能夠調(diào)控含鈣離子的激素，在生物、食品及醫(yī)藥領域有很高的價值[21]。為建立安全高效的25-OH VD3生物轉(zhuǎn)化合成新工藝，本文構(gòu)建了Vdh的重組表達菌株BacillussubtilisWB600/pMA5-vdh，并根據(jù)P450家族蛋白的光譜吸收特性，測定了Vdh的酶活力，確定了全細胞轉(zhuǎn)化VD3的方法，在30 ℃、pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，外加0.1 g/L的VD3反應48 h后，底物轉(zhuǎn)化率可達到10.36%。

a-溫度對轉(zhuǎn)化率的影響；b-pH對轉(zhuǎn)化率的影響；c-發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化率的影響；d-轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化率的影響圖7 不同條件對25-OH VD3轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 The influence of different conditions on the conversion rate of 25-OH VD3

Vdh在枯草芽孢桿菌中的成功表達將促進未來對VD3羥化酶結(jié)構(gòu)的研究，以了解VD3羥化酶如何與底物接觸并進行羥基化，也為25-OH VD3的生物轉(zhuǎn)化工藝提供了借鑒。本研究首次以枯草芽孢桿菌作為底盤細胞構(gòu)建了25-OH VD3生產(chǎn)途徑，相較于ABDULMUGHNI等[21]利用B.megaterium轉(zhuǎn)化VD3得到0.45 g/L的25-OH VD3，本研究得到的25-OH VD3的產(chǎn)量相對較低。這可能是由于枯草芽孢桿菌中所提供的輔因子不足，后續(xù)的研究可以對B.subtilisWB600做改造，進一步針對輔酶循環(huán)做深入探討，通過引入NADH來增加輔因子，從而促進25-OH VD3的生成。