高天宇，曾茂茂，何志勇，王召君，秦昉，陳潔

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

豆渣是大豆提取大豆蛋白或制取豆?jié){、豆腐等產(chǎn)生的副產(chǎn)物[1]，隨著大豆加工產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，全世界范圍內(nèi)每年大約可產(chǎn)生2 000萬(wàn)t豆渣[2]。豆渣中含有20%以上的蛋白質(zhì)，40%以上的膳食纖維以及種類(lèi)和含量豐富的氨基酸[3]，可作為優(yōu)良的膳食纖維等補(bǔ)充劑應(yīng)用于食品工業(yè)。然而，豆渣具有強(qiáng)烈的豆腥味，導(dǎo)致其難以在食品中大范圍應(yīng)用，常被作為飼料或直接丟棄，造成環(huán)境的污染與資源的浪費(fèi)[4]。

豆渣中不良風(fēng)味主要來(lái)源于加工過(guò)程中酶促氧化亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸所生成的小分子揮發(fā)性化合物[5]，主要為5～8碳的短鏈醛、酮和酸，如戊醛、己醛、己烯醛等。另外，加工過(guò)程中的光氧化反應(yīng)也會(huì)生成1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃等物質(zhì)[6]。常用的豆渣風(fēng)味改良方法有物理法、生物育種法、添加掩蔽劑和微生物發(fā)酵法等[5]。物理法主要利用高溫高壓處理抑制脂肪氧合酶活性或使其失去活性，以減少揮發(fā)性物質(zhì)的生成[7-8]。生物育種法旨在選育脂肪氧合酶缺失的新品種[9]。添加掩蔽劑依靠引入其他風(fēng)味來(lái)遮蔽豆腥味[10]。這些方法盡管都有一定的效果，但難以大范圍應(yīng)用且不能有效去除豆腥味。近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵改良豆制品風(fēng)味憑借其綠色、高效的特點(diǎn)廣受青睞，常用的菌種有乳酸菌、酵母等[2,11-13]，但現(xiàn)有菌種存在酸味、酒精味重的問(wèn)題，仍有較大提升空間。

擔(dān)子菌門(mén)食用型真菌如茯苓、靈芝、灰樹(shù)花等具有良好的風(fēng)味特征，在不同的生長(zhǎng)階段有不同的風(fēng)味特點(diǎn)，如李田田等[14]分析了灰樹(shù)花子實(shí)體中的揮發(fā)性化合物，檢測(cè)出了異戊醇與甲酸乙酯等具有芳香風(fēng)味的揮發(fā)性化合物；楊海芮等[15]檢測(cè)了樟芝發(fā)酵液中的揮發(fā)性化合物，發(fā)現(xiàn)香氣成分以醇類(lèi)為主。雖然現(xiàn)有研究多集中在食用菌子實(shí)體的風(fēng)味上，但這也指出了食用菌具有風(fēng)味改良的潛力。茯苓菌屬擔(dān)子菌門(mén)，是常見(jiàn)的食藥用真菌，常用于提取茯苓多糖[16]，生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生良好的風(fēng)味物質(zhì)，有望成為風(fēng)味改良菌種的良好選擇。

本文以豆渣為研究對(duì)象，利用茯苓菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(headspace-solid phase microextraction-GC-MS,HS-SPME-GC-MS)測(cè)定發(fā)酵后豆渣中揮發(fā)性化合物的種類(lèi)及含量變化，考察茯苓菌發(fā)酵豆渣的風(fēng)味改良效果和規(guī)律，為豆渣風(fēng)味改良提供新的菌種選擇，同時(shí)也為工業(yè)化發(fā)酵改良豆渣風(fēng)味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原材料

茯苓菌(Wolfiporiacocos)，菌種編號(hào)CGMCC 5.78，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;豆渣(豆粕提取大豆蛋白后的副產(chǎn)物),由河南平頂山金晶生物科技有限公司提供。

1.1.2 茯苓菌種子培養(yǎng)基配方

種子培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，VB10.1，pH 6.0。

1.1.3 試劑

2-甲基-3-庚酮(內(nèi)標(biāo))、正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C8～C26，1 000 mg/L)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIONSQ-456-GC氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)布魯克公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國(guó)Supelco公司；ZQZY78AN恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茯苓菌液體發(fā)酵的工藝流程

茯苓菌液體發(fā)酵方法參考文獻(xiàn)[17]并略有更改。挖取茯苓菌生長(zhǎng)尖端菌絲塊，接種到茯苓菌種子培養(yǎng)基(100 mL)，26 ℃，120 r/min，培養(yǎng)3 d，活化菌株。隨后按接種量10%將種子液接種到茯苓菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，26 ℃，120 r/min，培養(yǎng)3、5、7、9、11、13 d。

1.3.2 茯苓菌菌絲體干重的測(cè)定

將1.3.1中菌株發(fā)酵液收集，8 層紗布過(guò)濾沖洗菌絲，收集菌絲，置于60 ℃烘箱烘干至恒重，稱(chēng)量質(zhì)量并記錄。

1.3.3 茯苓菌液態(tài)發(fā)酵豆渣的工藝流程

稱(chēng)量豆渣4 g，置于250 mL三角瓶中，加入100 mL去離子水，攪拌均勻，120 ℃，20 min滅菌，作為液態(tài)發(fā)酵豆渣培養(yǎng)基備用。挖取茯苓菌菌絲生長(zhǎng)尖端菌絲塊，接種到茯苓菌種子培養(yǎng)基(100 mL)，26 ℃，120 r/min，培養(yǎng)3 d，活化菌株。隨后以10%接種量將種子液接種到液體發(fā)酵豆渣培養(yǎng)基，26 ℃，120 r/min，培養(yǎng)3、5、7、9 d，收集發(fā)酵產(chǎn)物，置于-80 ℃冰箱中保存。未經(jīng)處理的豆渣命名為原始豆渣，未接種茯苓菌但在相同培養(yǎng)條件下放置的豆渣命名為空白豆渣，接種茯苓菌并發(fā)酵的豆渣稱(chēng)為發(fā)酵豆渣。

1.3.4 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)揮發(fā)性化合物

1.3.4.1 SPME條件

取8.5 mL發(fā)酵產(chǎn)物于頂空瓶中，選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，60 ℃平衡30 min后，將已老化的萃取頭插入頂空瓶，在60 ℃條件下萃取30 min。萃取結(jié)束后，將萃取頭插入色譜進(jìn)樣口。

1.3.4.2 GC條件

色譜柱：安捷倫DB-WAX極性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，初始柱溫40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速率升溫至90 ℃，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7 min；載氣(He)流速為0.8 mL/min，不分流進(jìn)樣。

1.3.4.3 MS條件

電子轟擊(electron impact，EI)離子源；電子能量70 eV，掃描范圍為(m/z)50.0～500.0。

定性結(jié)果參照質(zhì)譜和WILEY138數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，同時(shí)采用C8～C26的正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)保留指數(shù)(retention index，RI)，與NIST Chemistry Webbook，SRD 69數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物的相對(duì)保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)化合物進(jìn)行定性分析。

以2-甲基-3-庚酮為定量?jī)?nèi)標(biāo)物，根據(jù)被檢測(cè)的化合物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積之比，對(duì)被檢測(cè)化合物進(jìn)行定量，表示為μg/L。

1.3.5 風(fēng)味活性值(odor activity value，OAV)的計(jì)算

風(fēng)味活性值是揮發(fā)性風(fēng)味化合物的濃度與其在水中的閾值的比值，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：OAVi為風(fēng)味化合物i的風(fēng)味活性值；Ci為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/L；Ti為揮發(fā)性風(fēng)味化合物在水中的閾值，μg/L。

1.3.6 感官評(píng)定

挑選食品專(zhuān)業(yè)的學(xué)生，按照感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10220的要求對(duì)感官分析人員進(jìn)行培訓(xùn)，挑選出10名(4男6女)學(xué)生進(jìn)行茯苓菌發(fā)酵液與發(fā)酵豆渣感官評(píng)定分析。感官評(píng)定人員通過(guò)直接嗅聞的方式給出了茯苓菌發(fā)酵液與發(fā)酵豆渣的7個(gè)風(fēng)味輪廓描述，分別為青草味、青澀味、土腥味、花香味、茶香味、甜香味和水果香，采用九分法對(duì)上述7個(gè)風(fēng)味輪廓及整體接受度進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品的處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Origin 8.0和Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)茯苓菌菌絲體干重的影響

茯苓菌菌絲體干重隨時(shí)間的變化如圖1所示，培養(yǎng)時(shí)間在5～10 d時(shí)，菌絲體干重增加速度最快，為茯苓菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。10 d后菌絲體干重增長(zhǎng)緩慢，而后趨于平穩(wěn)，進(jìn)入穩(wěn)定期。茯苓菌株在種子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況與金文松等[17]對(duì)茯苓菌株的研究類(lèi)似，由此可知，利用茯苓菌發(fā)酵豆渣的時(shí)間應(yīng)選擇在5～10 d。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)茯苓菌絲體干重的影響Fig.1 The effect of different fermentation duration on the dry weight of Wolfiporia cocos mycelium

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆渣風(fēng)味輪廓的影響

對(duì)原始豆渣與發(fā)酵3、5、7、9 d后的豆渣進(jìn)行感官評(píng)定并繪制風(fēng)味輪廓，如圖2所示，發(fā)酵前后產(chǎn)品的風(fēng)味輪廓有較大差異，在原始豆渣中突出的風(fēng)味特征為“青草味”、“青澀味”和“土腥味”，發(fā)酵后這些風(fēng)味特征大幅減少，且新產(chǎn)生了花香味、茶香味、甜香味和水果香味特征，說(shuō)明茯苓菌發(fā)酵明顯改良了豆渣的風(fēng)味。

圖2 發(fā)酵前后豆渣的風(fēng)味輪廓Fig.2 The flavor profiles of okara before and after fermentation

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆渣揮發(fā)性化合物的影響

原始及發(fā)酵豆渣中揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和相對(duì)含量結(jié)果如表1所示，原始豆渣中含有39種揮發(fā)性化合物，空白豆渣與原始豆渣揮發(fā)性化合物種類(lèi)相同且相對(duì)含量水平類(lèi)似。發(fā)酵3、5、7、9 d的豆渣中分別含有22、27、27、18種揮發(fā)性化合物。在原始豆渣中檢測(cè)出13種常見(jiàn)的不良風(fēng)味化合物[5,18]，含量較高的有己醛(54.31%)、正己醇(5.30%)、1-辛烯-3-醇(3.11%)、戊醛(3.03%)、反-2-已烯醛(1.99%)和順-6-壬烯醛(1.64%)，其他為庚醛、1-戊醇、癸醛、反-2-癸烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、5-戊基-2(5H)-呋喃酮，13種物質(zhì)的總相對(duì)含量為77.33%。豆渣中不良風(fēng)味化合物主要來(lái)源于原料加工過(guò)程中脂肪氧合酶導(dǎo)致的酶促氧化反應(yīng)[12]。另外，在光照條件下，亞油酸以及單線(xiàn)態(tài)氧介導(dǎo)的特殊光氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生1-辛烯-3-醇[6]。順-6-壬烯醛在文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道，可能是由于原料來(lái)源或加工方式的不同所造成。發(fā)酵豆渣中不良風(fēng)味化合物的相對(duì)含量顯著減少，發(fā)酵3 d后13種不良風(fēng)味化合物總相對(duì)含量由77.33%下降至66.48%，5、7、9 d后分別降至63.92%、31.49%、14.88%。由此可見(jiàn)，茯苓菌能夠在發(fā)酵過(guò)程中消減豆渣中本身存在的不良風(fēng)味化合物，且在9 d時(shí)的效果最好。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆渣揮發(fā)性化合物的影響Table 1 Effect of different fermentation duration on the volatile compounds of okara

發(fā)酵豆渣中檢測(cè)出了11種優(yōu)美風(fēng)味揮發(fā)性化合物，分別為正辛醛、甲基庚烯酮、壬醛、正庚醇、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、正辛醇、2-十一酮、苯乙酸甲酯、1-壬醇。在原始豆渣中僅檢出了正辛醛、壬醛、苯甲醛與正辛醇，且總相對(duì)含量為6.16%。發(fā)酵3、5、7、9 d后分別增加至21.03%、24.32%、57.43%、69.83%。另外，芳樟醇、2-十一酮與苯乙醇等揮發(fā)性化合物只在發(fā)酵豆渣中檢出，而未在原始豆渣與空白豆渣中檢出，說(shuō)明這些物質(zhì)均來(lái)自于茯苓菌發(fā)酵。芳樟醇、2-十一酮、1-壬醇、苯乙酸甲酯與苯乙醇在發(fā)酵9 d的產(chǎn)物中相對(duì)含量最高，分別可達(dá)到48.78%、2.86%、4.02%、13.63%和4.49%。由此可見(jiàn)，茯苓菌發(fā)酵能夠在減少不良風(fēng)味化合物的同時(shí)生成優(yōu)美風(fēng)味化合物，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，優(yōu)美風(fēng)味化合物含量逐漸升高。

2.4 茯苓菌發(fā)酵豆渣不良風(fēng)味揮發(fā)性化合物與優(yōu)美風(fēng)味揮發(fā)性化合物含量的變化

采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵前后產(chǎn)品中13種典型的不良風(fēng)味與12種優(yōu)美風(fēng)味化合物含量同時(shí)計(jì)算OAV，不良風(fēng)味化合物的含量變化如表2所示，空白豆渣中不良風(fēng)味化合物含量與原始豆渣類(lèi)似，說(shuō)明不良風(fēng)味化合物的含量變化主要來(lái)自于茯苓菌發(fā)酵。如果化合物的含量高于閾值即OAV>1，則能夠被感知到風(fēng)味特征[19]。6種OAV>1的化合物發(fā)酵前后OAV變化見(jiàn)圖3，原始豆渣中己醛OAV為20.24，對(duì)豆渣的不良風(fēng)味起到主要作用；順-6-壬烯醛具有較低的閾值，很容易被感知到，雖然豆渣中順-6-壬烯醛的質(zhì)量濃度僅為2.75 μg/L，但OAV可達(dá)137.45，使得體系具有強(qiáng)烈的青澀味。1-辛烯-3-醇具有蘑菇味和土腥味的特征，OAV達(dá)到5.22；反,反-2,4-壬二烯醛和反,反-2,4-癸二烯醛的閾值也較低，OAV分別達(dá)11.51 和3.51，加重了豆渣的不良風(fēng)味特征。經(jīng)過(guò)茯苓菌發(fā)酵后，這些物質(zhì)的OAV均明顯降低，其中發(fā)酵9 d的產(chǎn)物中，己醛OAV下降幅度達(dá)到98.20%，而順-6-壬烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛在發(fā)酵產(chǎn)物中均沒(méi)有檢出，說(shuō)明茯苓菌發(fā)酵能夠明顯削減豆渣中的不良風(fēng)味化合物。

表2 原始豆渣及發(fā)酵豆渣中主要不良風(fēng)味物質(zhì)含量Table 2 The contents of off-flavor compounds in okara before and after fermentation

圖3 豆渣發(fā)酵前后不良風(fēng)味物質(zhì)OAV的變化Fig.3 The OAV of off-flavor compounds in okara before and after fermentation

己醛主要來(lái)源于脂肪氧合酶酶促氧化過(guò)程，經(jīng)過(guò)茯苓菌發(fā)酵后，其含量減少的現(xiàn)象與利用其他微生物發(fā)酵豆類(lèi)產(chǎn)品所產(chǎn)生的現(xiàn)象相符，如利用乳酸菌發(fā)酵豆奶后，己醛含量可大幅減少甚至無(wú)法檢出[13]。這是因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)代謝過(guò)程中能夠通過(guò)自身產(chǎn)生的酸脫氫酶將己醛轉(zhuǎn)化為己酸，從而降低己醛的含量[20]。此外，己醛還可能作為微生物生長(zhǎng)發(fā)育的碳源之一，經(jīng)過(guò)酶促分解后參與三羧酸循環(huán)。值得注意的是發(fā)酵5 d的產(chǎn)物中己醛含量相較發(fā)酵3 d的產(chǎn)物有所增加，一部分己醛在豆渣中可能與蛋白進(jìn)行了共價(jià)結(jié)合而保存下來(lái)[21]，經(jīng)過(guò)茯苓菌的生長(zhǎng)代謝，蛋白質(zhì)被分解，這部分結(jié)合態(tài)的己醛被重新釋放出來(lái)，造成己醛含量的短暫增加。

發(fā)酵豆渣中具有優(yōu)美風(fēng)味的揮發(fā)性化合物的含量變化如圖4所示，原始豆渣中壬醛、正辛醛與正辛醇的含量較低，其風(fēng)味特征由于被不良風(fēng)味所掩蔽而無(wú)法被感知。接種茯苓菌后，芳樟醇和苯乙醇的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且均在7 d時(shí)達(dá)到最大值。苯乙酸甲酯與1-壬醇的含量在發(fā)酵9 d時(shí)達(dá)到最高。優(yōu)美風(fēng)味化合物的OAV如表3所示，除發(fā)酵3 d時(shí)，其余發(fā)酵豆渣中芳樟醇的OAV均大于1，表明芳樟醇的存在為發(fā)酵豆渣提供了花香味的風(fēng)味特征。發(fā)酵7 d時(shí)，芳樟醇、苯乙醇等物質(zhì)含量達(dá)到最大，這與茯苓菌的生長(zhǎng)特性一致，7 d時(shí)菌種生長(zhǎng)速度較快，使得風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生速度快，累積量多，而到9 d 時(shí)，由于菌種生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，增長(zhǎng)幅度較小。

表3 原始豆渣及發(fā)酵豆渣中主要的優(yōu)美風(fēng)味揮發(fā)性化合物OAVTable 3 The OAV of pleasant flavor compounds in okara before and after fermentation

圖4 豆渣及發(fā)酵豆渣中主要的優(yōu)美風(fēng)味揮發(fā)性化合物 含量的變化Fig.4 The contents of pleasant flavor compounds in okara before and after fermentation

芳樟醇是一種典型的萜醇類(lèi)化合物，具有花香味、茶香味的風(fēng)味特征，是食品工業(yè)中常見(jiàn)的一種香料[22]，在食用菌類(lèi)產(chǎn)品中應(yīng)用也很普遍，如廖川等[23]在茯苓普通粉中檢出了芳樟醇；劉振東等[24]在檢測(cè)了不同干燥方式的林芝松口蘑后，也檢出了相對(duì)含量15%以上的芳樟醇。食品工業(yè)中，通常使用引入芳樟醇合酶的釀酒酵母和大腸桿菌，通過(guò)催化內(nèi)源

性代謝產(chǎn)物香葉基二磷酸轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)合成[25]。在茯苓菌發(fā)酵豆渣產(chǎn)物中也檢測(cè)出了芳樟醇，說(shuō)明茯苓菌中可能存在芳樟醇合酶，使得茯苓菌能夠利用豆渣中的基質(zhì)合成芳樟醇。已有研究證實(shí)苯乙醇可以通過(guò)脫羧脫氫莽草酸途徑合成，或者借助Ehrlich途徑直接轉(zhuǎn)化苯丙氨酸合成[26]，這2種途徑均廣泛存在于微生物中，賈薇等[27]在食藥用真菌樟芝發(fā)酵液中檢出的主要香氣成分之一為苯乙醇，宋昊等[11]利用酵母發(fā)酵黃豆豆渣也檢出了苯乙醇。鑒于豆渣中氨基酸的種類(lèi)和含量豐富，茯苓菌能夠獲得充足的前體物質(zhì)，轉(zhuǎn)化生成苯乙醇。

3 結(jié)論

原始豆渣中檢測(cè)出己醛、1-辛烯-3-醇、順-6-壬烯醛等具有不良風(fēng)味的揮發(fā)性化合物，它們的存在造成了豆渣青草味、土腥味的風(fēng)味特征。接種茯苓菌后，發(fā)酵豆渣中的不良風(fēng)味顯著減少，且新具有了花香味、茶香味和甜香味的風(fēng)味特征。通過(guò)發(fā)酵，己醛、順-6-壬烯醛、1-辛烯-3-醇等化合物的含量明顯減少，在發(fā)酵9 d時(shí)含量下降最大；同時(shí)也產(chǎn)生了芳樟醇、2-十一酮、苯乙酸甲酯、苯乙醇等具有優(yōu)美風(fēng)味的揮發(fā)性化合物，在7 d時(shí)含量最高。綜合考慮風(fēng)味輪廓與感官的接受度，發(fā)酵時(shí)間7 d時(shí)感官得分和接受度最高。綜上所述，豆渣豆腥味改良的最佳條件為利用編號(hào)CGMCC 5.78茯苓菌液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)條件為26 ℃，120 r/min，培養(yǎng)時(shí)間7 d。茯苓菌產(chǎn)香的具體代謝通路仍不清晰，后續(xù)研究可進(jìn)一步探討其代謝通路，為豆渣風(fēng)味改良工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。