張石鑫，裴鴻艷，郎鈺瑩，張熹晗，張 坡，張 靜，張立新

(沈陽化工大學 功能分子研究所 遼寧省綠色功能分子設(shè)計與開發(fā)重點實驗室， 遼寧 沈陽 110142)

異噻唑類化合物于1959年由Adams和Slack首次發(fā)現(xiàn)并報道[1]，在農(nóng)藥領(lǐng)域，主要用作殺菌劑.該類化合物目前已有5個商品化品種(如圖1所示)：噻霉酮(benziothiazolinone)、烯丙異噻唑(oryzaemate)、異噻菌胺(isotianil)、dichlobentiazox及benclothiaz.噻霉酮由陜西西大華特科技實業(yè)有限公司獨家研制，目前僅在國內(nèi)使用，主要用于防治黃瓜霜霉病、梨黑星病、蘋果瘡痂病、柑橘炭疽病、葡萄黑痘病等多種細菌、真菌性病害[2]；烯丙異噻唑是由日本明治制果株式會社開發(fā)的一種殺菌劑，可防治水稻稻瘟病和葉枯病，并具有良好的內(nèi)吸活性和植物激活性能[3]；異噻菌胺由拜爾公司研制[4]，2010年在韓國上市，其商品名為Routine，主要用于水稻稻瘟病的防治[5]；Dichlobentiazox是由日本組合化學開發(fā)的一種苯并噻唑類殺菌劑，主要用于水稻稻瘟病的防治[6]；Benclothiaz是由先正達公司報道的一個具有殺線蟲作用的化合物，也可用于防治根瘤病[7].

圖1 已商品化的異噻唑類化合物Fig.1 Commercialized isothiazole

殺菌劑的使用是防治植物病害的重要手段，其中酰胺類殺菌劑在作物病害防治歷史中具有舉足輕重的地位.酰胺類殺菌劑的作用機制主要為通過影響病原菌的呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)而達到抑制病原菌的生長，從而導(dǎo)致病原菌死亡[8]；自成功開發(fā)以來，該類化合物作為殺菌劑已經(jīng)有50多年的歷史，其代表品種有氟吡酰菌胺和啶酰菌胺等(如圖2所示).

圖2 氟吡酰菌胺和啶酰菌胺化學結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of fluoplcollde and boscalid

然而，隨著簡單重復(fù)單一用藥模式的不斷增強，現(xiàn)有的酰胺類殺菌劑抗性問題日益突出,不斷研發(fā)新型結(jié)構(gòu)、新型作用機制的酰胺類殺菌劑則是解決這一難題的有效途徑.因此，本文選取異噻唑類化合物4-氨基-3-苯基-5-異噻唑甲酸乙酯(由美國FMC公司公開，具有良好的殺線蟲活性[9])作為先導(dǎo)化合物，并結(jié)合酰胺類殺菌劑的骨架特點，采用活性亞結(jié)構(gòu)拼接[10]、生物電子等排[11]策略，在4-氨基-3-苯基-5-異噻唑甲酸乙酯中引入酰胺類結(jié)構(gòu)，設(shè)計、合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的異噻唑酰胺類化合物(如圖3所示，式中R的具體取代情況見表1)，并對所合成的化合物進行了一系列殺菌活性測定.

圖3 目標化合物C-1～C-12的設(shè)計思路Fig.3 Design idea of compound C-1～C-12

根據(jù)藥物輔助設(shè)計理論和活性亞結(jié)構(gòu)拼接、生物活性等排原理推測異噻唑酰胺類殺菌劑在引入脂肪鏈與芳香鏈后logP值改變，隨著烷基鏈的延長，logP值增大，親脂性增強，滲透能力增加；在結(jié)構(gòu)中引入氟原子能增加有機分子的親脂性，由于氟原子能增加分子的親脂性，使得含氟化合物在生物體內(nèi)對膜、組織的穿透能力增加；引入氟原子可以在一定程度上改變藥物的物理化學性質(zhì)、提高藥物代謝穩(wěn)定性、改善藥物作用時間、增強藥效、消除活性代謝中間體等.另外此類殺菌劑作用機制新穎，對作用靶標可能具有一定的選擇性.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀，BRUKER Avance 300 MHz型，瑞士BRUKER公司；LC-MSD-Trap-VL&Agilent LC-MS 6130，安捷倫科技有限公司；全自動熔點測定儀，濟南海能儀器股份有限公司；BUCHI R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司.

實驗所用試劑均為市售化學純或分析純.

1.2 目標化合物的合成

目標化合物C-1～C-12的合成路線如圖4所示.

圖4 目標化合物C-1～C-12的合成路線Fig.4 Synthesis routes of compounds C-1～C-12

1.2.1 中間體的合成

1.2.1.1 苯甲酰腈肟鈉鹽(M-1)的合成

稱取苯乙腈23.41 g(0.20 mol)、氫氧化鈉8.15 g(0.20 mol)放入裝有機械攪拌、溫度計和尾氣吸收裝置的1000 mL三口瓶中，加入150 mL無水乙醇后，降溫至10～20 ℃.在此溫度下，向其中緩慢滴加含有28.11 g(0.24 mol)亞硝酸異戊酯的無水乙醇溶液50 mL.滴加完畢后，撤去冰浴，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2.5 h.TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后向反應(yīng)液中加入200 mL無水乙醚，攪拌30 min后過濾，濾餅用無水乙醚洗滌，空氣干燥、真空干燥(70～80 ℃)后得白色固體15.31 g，熔點286～288 ℃，質(zhì)量分數(shù)98.13 %，收率44.74 %.

1.2.1.2 1-(4-甲基苯磺酰基氧胺基)苯乙腈(M-2)的合成

稱取苯甲酰腈肟鈉鹽(M-1)14.55 g(87.00 mmol)和對甲苯磺酰氯16.51 g(87.00 mmol)放入500 mL的兩口瓶中，加入130 mL甲苯，升溫至回流，反應(yīng)3 h.TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，加入200 mL乙酸乙酯稀釋，有機層依次用100 mL水、100 mL飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥、過濾、減壓脫溶后得黃色固體22.11 g，熔點130～132 ℃，質(zhì)量分數(shù)97.15 %，收率82.67 %.

1.2.1.3 4-氨基-3-苯基-5-異噻唑甲酸乙酯(M-3)的合成

將1-(4-甲基苯磺?；醢坊?苯乙腈(M-2)22.10 g(74.00 mmol)、巰基乙酸乙酯10.68 g(89.00 mmol)放入裝有機械攪拌、溫度計和尾氣吸收裝置的1000 mL三口瓶中，加入200 mL甲醇后置于冰浴下操作.攪拌下向其中緩慢滴加三乙胺14.95 g(148 mmol)，滴加過程中維持反應(yīng)溫度不超過40 ℃.滴加完畢后撤去冰浴，室溫下再繼續(xù)反應(yīng)3 h.TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后加入150 mL乙酸乙酯稀釋，有機層依次用100 mL水、100 mL飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥、過濾、減壓脫溶，殘余物柱層析(洗脫劑為體積比1∶10的乙酸乙酯/石油醚)純化，得白色固體11.88 g，熔點46～48 ℃，質(zhì)量分數(shù)95.33 %，收率61.99 %.

1.2.2 目標化合物的合成

合成通法1：以化合物C-1為例，其合成路線為

將0.51 g(2.06 mmol)M-3與0.25 g(2.45 mmol)乙酸酐溶于10 mL甲苯中，回流反應(yīng)5 h.TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓脫溶，柱層析(洗脫劑為體積比1∶10的乙酸乙酯/石油醚)純化，得白色固體0.56 g，熔點108～110 ℃，質(zhì)量分數(shù)97.38 %，收率91.54 %.

合成通法2：以化合物C-12為例，其合成路線為

將0.43 g(1.73 mmol)M-3與0.28 g(2.00 mmol)苯甲酰氯溶于10 mL甲苯中，回流反應(yīng)5 h.TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓脫溶、柱層析(洗脫劑為體積比1∶10的乙酸乙酯/石油醚)純化，得白色固體0.58 g，熔點76～78 ℃，質(zhì)量分數(shù)95.53 %，收率90.84 %.

采用通法1合成化合物C-1～C-3；采用通法2合成化合物C-4～C-12.

化合物C-1～C-12的化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及反應(yīng)收率見表1.

表1 化合物C-1～C-12物化常數(shù)Table 1 Physicochemical data of compounds C-1～C-12

1.3 殺菌活性測定

活體保護活性測定：采用活體盆栽測定方法.待測化合物原藥用少量丙酮[V(丙酮)/V(噴液)=0.05]溶解，用含有0.1 %(體積分數(shù)，下同)吐溫80的水稀釋至質(zhì)量濃度400 mg/L、100 mg/L、25 mg/L和6.25 mg/L的待測液.噴霧施藥到植物試材上，24 h后進行病害接種.接種后，將植物放在人工氣候室中培養(yǎng)，24 h后將植物試材移入溫室培養(yǎng).待對照充分發(fā)病后(通常為1周時間)進行化合物防病效果評估.

離體殺菌活性測定：待測化合物原藥用DMSO溶解，配制成質(zhì)量濃度2000 mg/L的待測液.取適量待測液加到96孔培養(yǎng)板的小孔中，再將79 μL病原菌孢子或孢子囊懸浮液加入其中，配制質(zhì)量濃度為25 mg/L、8.3 mg/L、2.8 mg/L和0.9 mg/L的待測液，處理后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后進行調(diào)查，調(diào)查時目測每個處理的孢子或孢子囊萌發(fā)情況，并根據(jù)DMSO處理的萌發(fā)情況，評價化合物抑菌率.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標化合物的結(jié)構(gòu)表征

合成的目標化合物均經(jīng)1H-NMR及LC-MS確證，C-1～C-12的表征數(shù)據(jù)如下所示.

C-1,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.19(bs,1H，NH),7.58～7.78(m,2H,3,5-2H),7.41～7.44(m,3H,2,4,6-3H),4.41(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),2.12(s,3H,COCH3),1.41(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):291.1[M+1].

C-2,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.02(s,1H,NH),7.59～7.64(m,2H,3,5-2H),7.42～7.46(m,3H,2,4,6-3H),4.45(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),1.42(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):344.8[M+1].

C-3,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.24(s,1H,NH),7.65～7.68(m,2H,3,5-2H),7.38～7.42(m,3H,2,4,6-3H),4.39(q,J=6.9 Hz,2H,OCH2),2.33(q,J=7.2 Hz,2H,COCH2),1.39(t,J=6.9 Hz,3H,CH3),1.14(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):304.7[M+1].

C-4,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.12(s,1H,NH),7.66～7.69(m,2H,3,5-2H),7.43～7.47(m,3H,2,4,6-3H),4.44(q,J=7.2 Hz,2H,OCH2),4.11(s,2H,CH2),1.42(t,J=7.2 Hz,3H).LC-MS(m/z):326.2[M+1].

C-5,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.65(s,1H,NH),7.63～7.65(m,2H,3,5-2H),7.37～7.40(m,3H,2,4,6-3H),4.41(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),1.41(t,J=7.2 Hz,3H,CH3),1.25(s,9H,3CH3).LC-MS(m/z):332.9[M+1].

C-6,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.73(s,1H,NH),7.64～7.65(m,2H,3,5-2H),7.39～7.41(m,3H,2,4,6-3H),4.42(q,J=6.9 Hz,2H,OCH2),1.59(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),1.41(t,J=6.9 Hz,3H,CH3),1.20(s,6H,2CH3),0.83(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):347.2[M+1].

C-7,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.62(s,1H,NH),7.70～7.71(m,2H,3,5-2H),7.40～7.42(m,3H,2,4,6-3H),6.08(d,J=7.8 Hz,1H,C===CH),4.43(q,J=7.5 Hz,2H,OCH2),2.19～2.21(m,2H,2CH),1.43(t,J=7.5 Hz,3H,CH3),1.31(s,3H,CH3),1.10(s,3H,CH3).LC-MS(m/z):439.9[M+1].

C-8,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:7.53～7.56(m,2H,3,5-2H),7.39～7.46(m,3H,2,4,6-3H),7.22～7.28(m,3H,Ph-3′,4′,5′-3H),7.02～7.05(m,2H,Ph-2′,6′-2H),4.22(q,J=7.2 Hz,OCH2),3.87(s,2H,CH2),1.30(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):367.3[M+1].

C-9,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.42(s,1H,NH),7.39～7.41(m,4H,Ph-2′,3′,5′,6′-4H),7.28～7.31(m,1H,3-H),7.18～7.22(m,4H,2,4,5,6-4H),4.38(q,J=7.5 Hz,CH2),2.25～2.38(m,1H,CH),1.38(t,J=7.5 Hz,3H,CH3),1.08(d,J=6.6 Hz,1H,CH),1.00(d,J=6.6 Hz,3H,CH3),0.70(d,J=6.3 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):444.3[M+1].

C-10,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.28(bs,1H,NH),7.46～7.49(m,1H,Ph-3′-H),7.39～7.40(m,2H,3,5-2H),7.18～7.19(m,3H,2,4,6-3H),6.99(d,J=8.7 Hz,1H,Ph-5′-H),6.78(d,J=8.7 Hz,1H,Ph-6′-H),4.68(s,2H,COCH2),4.27(q,J=7.2 Hz,2H,OCH2),1.29(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):451.8[M+1].

C-11,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.08(bs,1H,NH),8.51(d,J=8.7 Hz,1H,pyridine-4-H),8.07(d,J=6.3 Hz,1H,pyridine-6-H),7.57～7.77(m,2H,3,5-2H),7.43～7.45(m,3H,2,4,6-3H),7.27～7.47(m,1H,pyridine-5-H),4.43(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),1.41(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):389.2[M+1].

C-12,1H-NMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.26(s,1H,NH),7.88～7.91(m,2H,Ph-2′,6′-2H),7.76～7.79(m,2H,Ph-3′,5′-2H),7.56～7.59(s,1H,Ph-4′-H),7.47～7.52(m,2H,3,5-2H),7.39～7.41(m,3H,2,4,6-3H),4.41(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),1.40(t,J=7.2 Hz,3H,CH3).LC-MS(m/z):353.3[M+1].

2.2 目標化合物的殺菌活性

化合物C-1～C-12殺菌試驗結(jié)果見表2、表3.

表2 目標化合物的殺(抑)菌活性研究初篩試驗Table 2 Primary screening test on bactericidal(inhibitory) activity of target compounds

表3 目標化合物的殺(抑)菌活性研究復(fù)篩試驗Table 3 Rescreening test on bactericidal(inhibitory) activity of target compounds

由表2、表3可以看出：目標化合物C-1～C-12對玉米銹病、水稻稻瘟病、黃瓜灰霉病具有一定的抑菌活性，而對于黃瓜霜霉病、小麥白粉病基本無效；就整體而言，R為脂肪鏈片段的化合物(C-1～C-7)活性高于R為含芳香族片段的化合物(C-8～C-12)；化合物C-2在質(zhì)量濃度為0.9 mg/L下對水稻稻瘟病的殺菌活性可達100 %，在2.8 mg/L下對黃瓜灰霉病的殺菌活性可達80 %；化合物C-5在質(zhì)量濃度為400 mg/L和25 mg/L下分別對玉米銹病和水稻稻瘟病的殺菌活性均可達到100 %；然而當試驗劑量進一步降低后，化合物C-5對玉米銹病和水稻稻瘟病基本無效.

3 結(jié) 論

綜合以上殺菌活性測試結(jié)果分析，目標化合物C-1～C-12中含芳香族片段的化合物活性較差，推測可能的原因是芳香族片段空間位阻大，與靶點結(jié)合度差，無法進入到作用位點；而含脂肪鏈片段的化合物活性相對較好，尤其是化合物C-2具有明顯優(yōu)良的殺菌活性，推測應(yīng)是三氟甲基基團起到了關(guān)鍵作用?；衔顲-2可作為先導(dǎo)化合物進行深入研究，例如可以進一步考察引入多個氟原子，以期待發(fā)現(xiàn)具有更高殺菌活性的異噻唑酰胺類化合物.