張蓬勃，宋艷玲

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸的立體結(jié)構(gòu)十分獨特，是一類生物活性多樣化的天然產(chǎn)物，具有保肝、抗炎、降血糖、降血脂和抗病毒[1-4]等作用，特別是其具有很強的抗腫瘤活性[5]，由于其對腫瘤細胞選擇性的毒性作用而對正常細胞并無不良影響的特性，使此類化合物成為國內(nèi)外抗腫瘤藥物重點研究的對象之一.齊墩果酸對非小細胞癌、黑色素瘤及卵巢癌等均表現(xiàn)出一定的抑制能力[6]；另外，齊墩果酸還可抑制K562白血病細胞株的生長，并促使細胞凋亡[7]；對肺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)齊墩果酸可介導(dǎo)其細胞的凋亡進程.總之，針對齊墩果酸抗腫瘤活性的研究表明齊墩果酸可介導(dǎo)腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移以及凋亡，其作用機理貫穿了腫瘤發(fā)展的各個階段[8].

Chen等[9]將苯磺?；秽趸铩⒈交秽趸锱c琥珀酸基經(jīng)反應(yīng)偶聯(lián)到齊墩果酸的C-3位羥基，合成了一系列齊墩果酸雜合呋喃唑酮衍生物.研究發(fā)現(xiàn)，此類化合物能控制一氧化氮的合成與釋放，是一種潛在的肝癌治療藥物，化合物濃度為1 μmol/L時，對肝癌細胞HepG2的抑制率為100 %，為活性最佳的化合物.蘇春華等[10]先將乙酰氧基連入齊墩果酸的C-3位，再將C-28位羧基與α-氨基磷酸酯通過酰胺鍵引入到C-3位的乙酰氧基上，合成了一類齊墩果酸α-氨基磷酸酯衍生物.其體外抗腫瘤活性顯示，對HeLa細胞的抑制率超過了78 %.查閱已發(fā)表的文獻，對齊墩果酸的結(jié)構(gòu)改造多為C-3位和C-28位，本文對齊墩果酸A環(huán)進行開環(huán)反應(yīng)，從而設(shè)計一系列新型化合物，以期提高目標化合物的生物活性和生物利用度.擴展了齊墩果烷型五環(huán)三萜的結(jié)構(gòu)多樣性，這對于OA的進一步開發(fā)利用具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600型核磁共振儀，美國Bruker公司；Büchi B-540熔點測定儀，瑞士Büchi公司；薄層色譜(GF-254)、柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工有限公司；齊墩果酸(質(zhì)量分數(shù)98 %)，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；芳香胺類藥品，上海麥克林生化科技有限公司.其他溶劑和藥品均為分析純.

1.2 合成實驗

齊墩果酸衍生物合成路線圖1所示.

反應(yīng)試劑和條件:(a) 瓊斯試劑,丙酮,異丙醇,0 ℃; (b) 甲酸乙酯,甲苯,甲醇鈉,25 ℃; (c) 甲醇鈉,質(zhì)量分數(shù)30 %的過氧化氫,甲醇,室溫; (d) 芳香酰氯,二氯甲烷,40 ℃; (e) 芳香胺,4-二甲氨基吡啶,吡啶,室溫.

1.2.1 3-羰基-齊墩果酸(1)的制備

將齊墩果酸(4.40 g，9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中，冰浴下緩慢滴加瓊斯試劑(11.5 mL)，直至反應(yīng)液橘紅色不再消失，滴畢，室溫下反應(yīng)1～2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)完畢，加入130 mL異丙醇淬滅.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除部分溶劑，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得淡黃綠色固體，干燥，甲醇重結(jié)晶得白色晶體化合物3-羰基-齊墩果酸4.15 g，產(chǎn)率95 %，mp 186～187 ℃(文獻mp 185～186 ℃)[9].

1.2.2 2-羥基亞甲基-3-羰基-齊墩果酸(2)的制備

將3-羰基-齊墩果酸(4.15 g，8.87 mmol)溶于50 mL無水甲苯中，加入質(zhì)量分數(shù)97 %甲酸乙酯(2.0 mL)、甲醇鈉(3.76 g，69.54 mmol)25 ℃下反應(yīng)3 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后加入適量二氯甲烷稀釋，質(zhì)量分數(shù)5 %鹽酸洗滌3次，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物2-羥基亞甲基-3-羰基-齊墩果酸3.73 g，產(chǎn)率89.8 %，mp 210～214 ℃(文獻mp 211-212 ℃)[9].

1.2.3 2,3-甲酯基-齊墩果酸(3)的制備

將2-羥基亞甲基-3-羰基-齊墩果酸(2 g，4.14 mmol)溶于100 mL甲醇中，加入甲醇鈉(2.24 g，41.40 mmol)，冰浴條件下滴加質(zhì)量分數(shù)30 %的H2O2(10 mL)，0.5 h后撤冰，室溫下反應(yīng)3 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后二氯甲烷萃取，蒸餾水洗滌，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物2,3-甲酯基-齊墩果酸1.32 g，產(chǎn)率66 %，mp 221.3～223.7 ℃.

1.2.4 2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(4)的制備

將2,3-甲酯基-齊墩果酸(1 g，1.89 mmol)溶于20 mL干燥二氯甲烷溶液中，冰浴條件下緩慢滴加草酰氯(1.19 g，9.43 mmol)，0.5 h后撤冰，40 ℃下反應(yīng)2h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后蒸發(fā)有機溶劑，干燥環(huán)己烷沖洗3次，蒸發(fā)得白色固體化合物2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯0.98 g，產(chǎn)率98 %.

1.2.5 化合物Ⅰ1-Ⅰ4的制備

1.2.5.1 化合物Ⅰ1的制備

將2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)溶于10 mL無水二氯甲烷中，緩慢滴入溶于10 mL苯胺(0.128 g，1.37 mmol)的二氯甲烷溶液，加入干燥吡啶(0.5 mL)，4-二甲氨基吡啶(0.001 4 g，0.04 mmol)25～30 ℃條件下反應(yīng)12 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后二氯甲烷萃取，蒸餾水洗滌，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，硅膠柱色譜分離,甲醇/二氯甲烷洗脫,得白色固體化合物Ⅰ10.083 g，產(chǎn)率55.3 %，mp 181～184 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13)，δ：7.88～7.83(2H,m,ph-H-2,H-6),7.51(1H,t,J=7.1 Hz,ph-H-4),7.16～7.07(2H,m,ph-H-3,H-5),6.48(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.56(3H,s,3-COOCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.00(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-29),0.93(3H,s,H-27),0.91(3H,s,H-30).

1.2.5.2 化合物Ⅰ2的制備

實驗步驟同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)與對甲基苯胺(0.148 g，1.37 mmol)反應(yīng)，得白色固體化合物 Ⅰ20.079 g，產(chǎn)率52.6 %，mp 185～188 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13),δ：7.57～7.52(2H,m,ph-H-2,H-6),7.15～7.07(2H,m,ph-H-3,H-5)，6.50(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.38(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.56(3H,s,3-COOCH3),2.33(3H,d,J=9.2 Hz,ph-CH3)，1.21(6H,s,H-23、H-24),1.01(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-29),0.93(3H,s,H-27),0.89(3H,s,H-30).

1.2.5.3 化合物Ⅰ3的制備

實驗步驟同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)與對氯苯胺(0.175 g，1.37 mmol)反應(yīng)，得白色固體化合物 Ⅰ30.073 g，產(chǎn)率48.6 %，mp 184～185 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13)，δ：7.99(2H,d,J=8.8 Hz,ph-H-2,H-6),7.65(2H,d,J=8.7 Hz,ph-H-3,H-5),6.51(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.53(3H,s,3-COOCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.08(3H,s,H-25),0.89(3H,s,H-26),0.86(3H,s,H-29),0.82(3H,s,H-27),0.79(3H,s,H-30).

1.2.5.4 化合物Ⅰ4的制備

實驗步驟同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齊墩果酸酰氯(0.15 g，0.274 mmol)與鄰甲氧基苯胺(0.169 g，1.37 mmol)反應(yīng)，得白色固體化合物 Ⅰ40.066 g，產(chǎn)率44 %，mp 187～188 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13)，δ：8.01(1H,t,J=7.2 Hz,ph-H-3),7.88～7.83(2H,m,ph-H-4,H-6),7.40(1H,t,J=7.1 Hz,ph-H-5),6.51(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.53(3H,s,3-COOCH3),2.54(3H,s,ph-OCH3)，1.20(6H,s,H-23、H-24),1.04(3H,s,H-25),0.93(3H,s,H-26),0.89(3H,s,H-29),0.83(3H,s,H-27),0.80(3H,s,H-30).

2 抗腫瘤活性實驗結(jié)果與討論

選取舒尼替尼為陽性對照藥，舒尼替尼結(jié)構(gòu)中含有脲基活性片段，其抑制活性具有參考意義.取對數(shù)生長期的人肺癌細胞(A549)和人胃癌細胞(SGC7901)以每孔5×103個接種于96孔板內(nèi)，每組3個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用.待細胞貼壁后,分別加入待測化合物(Ⅰ1～Ⅰ4)、OA和舒尼替尼，藥品濃度為10 μmol/L，空白組為陰性對照組，舒尼替尼為陽性對照組.培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h.加入MTT溶液(5 g/L，20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，震蕩器上震蕩5 min，然后用酶標儀于570 nm處測OD值，重復(fù)3次實驗，取平均值，計算各組細胞的IC50.

抑制率=(對照組OD值-藥物組OD值)/對照組OD值×100 %.

化合物抗腫瘤活性和抑制率見表1.由表1數(shù)據(jù)可以看出：化合物Ⅰ4對A549、SGC7901細胞具有良好的抑制作用，優(yōu)于陽性對照藥舒尼替尼(13.3 μmol·L-1)；苯環(huán)上取代官能團的改變，其抑制率具有差別；鄰位的甲氧基團活性最好，氯原子活性稍差(21.8 μmol·L-1)，對位甲基活性差(26.1 μmol·L-1)，無取代基苯環(huán)活性最低(35.3 μmol·L-1).設(shè)計合成的4個化合物均優(yōu)于原料OA.

表1 化合物對A549和SGC7901細胞株的抗腫瘤活性Table 1 Anti-tumor activity of the target compounds on A549 and SGC7901 cell lines

3 結(jié) 論

設(shè)計并合成了4個未見文獻報道的OA衍生物(Ⅰ1～Ⅰ4)，活性實驗表明除化合物Ⅰ1外，其他化合物對A549和SGC7901細胞均有明顯的抑制作用.尤其是化合物Ⅰ4對A549細胞具有良好的抑制作用，優(yōu)于陽性對照藥舒尼替尼.該類化合物構(gòu)效關(guān)系正在進一步研究，該研究結(jié)果對齊墩果酸衍生物的進一步優(yōu)化設(shè)計具有一定的指導(dǎo)意義.