吳 蓓 高春輝 陶連元 盧 沛 陳 景

我國作為肝炎大國，原發(fā)性肝癌(PHC)的發(fā)生率一直維持在較高水平，流行病學研究證實，我國PHC的發(fā)病率可達236～472/10萬人左右[1]。臨床上PHC的發(fā)生能夠?qū)е禄颊吒喂δ芩ソ?、多器官功能障礙和病死率的上升[2]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子O家族1(FoxO1)是叉頭轉(zhuǎn)錄家族的重要成員，其能夠通過抑制癌細胞轉(zhuǎn)錄活性的激活，降低癌細胞的過度增殖風險，進而參與到早期惡性腫瘤的發(fā)生過程中[3]。FoxO1還能夠提高癌細胞的分化成熟能力，降低癌細胞的異型性。部分研究者探討了FoxO1在其他惡性腫瘤患者中的表達情況，認為FoxO1的表達缺失與卵巢或者乳腺腫瘤的臨床分期的進展或者癌細胞形態(tài)的改變密切相關(guān)[4-5]，但對于FoxO1與PHC的關(guān)系研究不足。為了揭示FoxO1的表達與PHC的發(fā)生關(guān)系，深入揭示PHC的發(fā)病機制，本次研究選取我院2015年1月至2017年5月收集的90例術(shù)后PHC組織標本，探討了FoxO1的表達及其與PHC患者臨床病理特征的關(guān)系，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年1月至2017年5月收集的90例術(shù)后PHC癌組織標本為PHC組，癌旁組織標本為癌旁組。PHC患者，年齡43～75歲，平均為(54.2±9.6)歲，男性53例，女性37例；病灶直徑：≥5 cm 41例、<5 cm 49例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期28例、Ⅲ期32例、Ⅳ期10例；AFP水平：>200 ng/ml 54例、≤200 ng/ml 36例。納入標準：①原發(fā)性肝癌患者的診斷標準參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范2014年版》中的標準；②患者經(jīng)術(shù)后病理學檢查證實為原發(fā)性肝細胞性肝癌；③癌旁組為距離腫瘤病灶邊緣5 cm以內(nèi)的肝組織；④研究方案獲得醫(yī)學倫理委員會同意后實施。排除標準：①轉(zhuǎn)移性肝癌；②長期使用免疫抑制劑等藥物；③HIV感染患者；④手術(shù)前具有放化療病史。

1.2 免疫組化染色方法

采用石蠟切片，脫水操作后采用3%H2O2室溫條件下孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，磷酸鹽緩沖液稀釋后的山羊血清封閉抗體5 min，倒去血清后不清洗，加入一抗(購自賽默飛世爾中國 濃度：1∶1000)5 ml，37 ℃孵育2 h，或者放置4 ℃冰箱過夜孵育，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，加入生物素熒光標記的二抗(購自賽默飛世爾中國 濃度：1∶2000)3 ml，37 ℃孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，加入Streptavidin/HRP辣根酶標記鏈霉卵白素，37 ℃孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒 (PA110)顯色，自來水沖洗，復染，封片。

1.3 免疫組化染色分析的結(jié)果判定

染色分析的結(jié)果判定：FoxO1蛋白主要分布于細胞核中，F(xiàn)oxO1蛋白的陽性染色在顯微鏡下均表現(xiàn)為黃色、棕黃色甚至褐色。①FoxO1蛋白在細胞中的染色程度分為：未染色(0分)、僅僅淡黃色染色(1分)、棕黃色染色(2分)、染色呈褐色、黑色(3分)；②根據(jù)染色的細胞占比結(jié)果：占比≤10%計分1分、占比范圍11%～50%計分2分、占比范圍51%～75%計分3分、占比>75%計分4分，染色程度與陽性細胞計分之乘積<3分為陰性、≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 PHC組與癌旁組中的FoxO1蛋白陽性率比較

PHC組織中FoxO1蛋白陽性表達率為43.33%，顯著低于癌旁組織的80.00%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組標本中FoxO1蛋白陽性率比較(例，%)

2.2 不同病理學特征PHC組織中FoxO1蛋白陽性率比較

TNM分期(Ⅰ期、Ⅱ期)、單發(fā)病灶、病灶直徑<5 cm的PHC組織中FoxO1蛋白陽性表達率顯著高于TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、多發(fā)病灶、病灶直徑≥5 cm的PHC組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同病理學特征PHC組織中FoxO1蛋白陽性率比較(例，%)

2.3 FoxO1蛋白陽性與陰性表達PHC患者3年生存情況比較

FoxO1蛋白陽性表達PHC患者3年生存率(64.10%)，高于陰性表達組的37.25%(P<0.05)，見表3。

表3 FoxO1蛋白陽性與陰性表達的PHC患者3年生存情況比較(例，%)

2.4 多因素分析

采用COX比例風險回歸模型分析，結(jié)果顯示：TNM分期增高、發(fā)生脈管癌栓、肝硬化、FoxO1蛋白表達下調(diào)是PHC患者不良預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 多因素分析結(jié)果

3 討論

PHC是較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其短期內(nèi)病情進展速度較快，遠期復發(fā)及轉(zhuǎn)移的風險較高。在長期乙肝病毒感染或者致癌因子接觸的條件下，小葉上皮細胞的異常分裂過程，能夠顯著增加PHC的發(fā)生風險[6]。臨床上PHC患者的中位生存時間或者五年生存率等生存預(yù)后指標較差，其中位生存時間不足34個月，五年生存率不足40%[7-8]。不同的臨床病理因素均能夠影響到PHC的病情進展，而通過對于不同臨床影響因素的分析，不僅能夠揭示PHC的部分發(fā)病病因，同時還能夠在PHC患者出院后隨訪方面發(fā)揮作用。

FoxO1蛋白能夠調(diào)控癌細胞細胞周期調(diào)控依賴性蛋白激活的轉(zhuǎn)錄及翻譯，增加G0/S期比例，穩(wěn)定癌細胞周期[9]。分子機制方面的研究顯示，F(xiàn)oxO1蛋白表達濃度的改變在促進癌細胞分化成熟、降低癌細胞的粘附能力等方面同樣發(fā)揮了重要的作用[10]。部分研究者已經(jīng)探討了FoxO1蛋白在肝癌患者中的表達情況，認為FoxO1蛋白的表達缺失與肝癌的早期發(fā)生密切相關(guān)[11]。

FoxO1蛋白在病例組患者中的表達明顯下降，表明FoxO1蛋白的表達缺失可能影響到了PHC的早期發(fā)生過程。下列因素可能影響到了相關(guān)機制的發(fā)生和進展[12-14]：①FoxO1蛋白的表達缺失導致癌細胞的增殖調(diào)控異常，癌細胞的持續(xù)性自我增殖能力持續(xù)上升；②FoxO1蛋白的表達缺失可導致癌細胞的侵襲能力明顯改變，上皮細胞突破基底膜的風險明顯的增強。陳俊任等[15]研究者也在探討PHC的發(fā)病機制過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1蛋白在PHC患者中的表達陽性率可平均下降35%以上，特別是在中晚期惡性腫瘤或者遠期病死率較高的患者中，F(xiàn)oxO1蛋白的表達濃度可進一步的下降。對于FoxO1蛋白的表達與PHC的關(guān)系研究可見，在臨床分期較早、單發(fā)病灶或者腫瘤直徑較小的PHC患者中，F(xiàn)oxO1蛋白的表達陽性率可顯著的上升，提示了FoxO1蛋白的表達對于PHC患者臨床分期等病理特征的影響，這主要由于FoxO1蛋白的表達缺失能夠提高癌細胞對于臨近正常肝臟上皮組織的侵襲能力，導致癌細胞癌栓深度和癌栓范圍的增加，提高了PHC的臨床分期；而FoxO1蛋白的表達缺失對于腫瘤直徑等的影響，考慮與肝臟上皮細胞增殖特性的改變有關(guān)。但本次研究中，并未發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白的表達與PHC患者脈管癌栓或者甲胎蛋白(AFP)的關(guān)系，考慮可能與本次研究的樣本量限制有關(guān)。FoxO1蛋白陽性表達率PHC患者3年生存率64.10%高于陰性表達組的37.25%，提示了FoxO1蛋白的表達與PHC患者臨床預(yù)后的關(guān)系，這主要由于FoxO1蛋白的表達陽性率的維持，能夠穩(wěn)定腫瘤細胞的生物學特征，降低腫瘤細胞復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險，最終影響到臨床預(yù)后。最后本次研究發(fā)現(xiàn)，TNM分期增高、發(fā)生脈管癌栓、肝硬化、FoxO1蛋白表達下調(diào)是PHC患者不良預(yù)后的獨立危險因素，提示臨床上對于具有相關(guān)高危臨床特征表現(xiàn)的患者，應(yīng)注意對于患者的隨訪，采用綜合性的治療措施，從而改善PHC的臨床結(jié)局。

綜上所述，在PHC患者中，F(xiàn)oxO1蛋白的表達明顯的下降，同時FoxO1蛋白的表達缺失與PHC患者的臨床病理特征和臨床預(yù)后密切相關(guān)。