CSCO生物統(tǒng)計(jì)學(xué)專家委員會(huì)RWS方法學(xué)組

高 雪1 薛付忠2 黃麗紅3 王 彤1△ 執(zhí)筆 陳 峰4 夏結(jié)來(lái)5 主審

隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(randomized controlled trial，RCT)是評(píng)價(jià)因果效應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于受到倫理學(xué)、受試者依從性、研究期限等因素的制約，很多情況下難以實(shí)施。另外，RCT中納入排除標(biāo)準(zhǔn)的限制可能導(dǎo)致研究樣本與真實(shí)世界的人群出現(xiàn)異質(zhì)性，因此研究結(jié)論的外推性也有待驗(yàn)證。相比之下，觀察性研究和非隨機(jī)對(duì)照研究數(shù)據(jù)更易獲得，在樣本的選擇上也更接近真實(shí)世界的情況[1]。然而，觀察性或非隨機(jī)對(duì)照研究設(shè)計(jì)需借助恰當(dāng)?shù)囊蚬Ｐ蛠?lái)推斷暴露因素(干預(yù))與疾病結(jié)局之間的因果關(guān)聯(lián)。

孟德?tīng)栯S機(jī)化(Mendelian randomization，MR)是以遺傳變異作為工具變量的統(tǒng)計(jì)模型。MR最早由Katan在探討低血清膽固醇水平會(huì)直接增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的假設(shè)中提出，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于因果關(guān)聯(lián)研究中[2-4]。MR利用遺傳變異在配子形成過(guò)程中隨機(jī)分裂與組合的特性模擬對(duì)人群的隨機(jī)分配過(guò)程：個(gè)體在出生時(shí)是否攜帶影響特定表型的遺傳變異是隨機(jī)的，而遺傳變異在配子形成過(guò)程中既已確定，這一過(guò)程通常與后天的環(huán)境混雜因素是不相關(guān)的。因此，攜帶該變異與不攜帶該變異的人群在某結(jié)局上的差異則可以歸因于暴露因素的變異，從而排除混雜因素的干擾[5](圖1)。利用遺傳變異作為工具變量的主要優(yōu)勢(shì)在于：遺傳變異的形成獨(dú)立于社會(huì)環(huán)境、生活習(xí)性和其他性狀，這一特性保證了各個(gè)混雜因素在遺傳變異的不同亞組間的均衡性，理論上避免了混雜因素的影響；另一方面，遺傳變異的形成先于環(huán)境暴露、混雜及疾病結(jié)局的發(fā)生及水平變化，由遺傳變異作為暴露的工具變量所解釋的暴露變異也是先于結(jié)局的，由此排除了逆向因果問(wèn)題[6]。

圖1 孟德?tīng)栯S機(jī)化和隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的比較

MR模型作為一種能夠校正未測(cè)量混雜估計(jì)因果效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，在醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用，但針對(duì)模型的應(yīng)用前提、核心假設(shè)、分析步驟以及結(jié)果解釋等問(wèn)題，還需進(jìn)行一些必要的考慮與評(píng)價(jià)。為此中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)專家委員會(huì)RWS方法學(xué)小組，經(jīng)充分討論，形成以下應(yīng)用共識(shí)，以期促進(jìn)MR模型的規(guī)范化應(yīng)用和規(guī)范化報(bào)道。

MR模型的基本假設(shè)及常見(jiàn)的MR方法

1.MR模型的基本假設(shè)

遺傳變異作為有效的工具變量需要滿足以下核心假設(shè)(圖2)：

圖2 工具變量核心假設(shè)Z：工具變量；X：暴露；Y：結(jié)局；U：混雜

(1)關(guān)聯(lián)性：遺傳變異Z與暴露X相關(guān)(γ≠0)；

(2)獨(dú)立性：遺傳變異Z與影響“暴露—結(jié)局”關(guān)聯(lián)關(guān)系的混雜因素U獨(dú)立(φ1=0)；

(3)排他性：遺傳變異Z僅通過(guò)暴露X影響結(jié)局Y(φ2=0) 。

按照研究設(shè)計(jì)的不同，MR模型可以分為單樣本MR模型與兩樣本MR模型。

2.單樣本MR模型(one-sample MR)

單樣本MR模型是指使用來(lái)自單個(gè)樣本的數(shù)據(jù)構(gòu)建MR模型，模型主要應(yīng)用個(gè)體數(shù)據(jù)(individual data)作為研究樣本，樣本中同時(shí)包含每一個(gè)體的遺傳變異、暴露以及結(jié)局的測(cè)量數(shù)據(jù)。

系數(shù)比估計(jì)量(比例估計(jì)值)的置信區(qū)間可通過(guò)正態(tài)近似法或Bootstrapping法得到。

此外，還可通過(guò)兩階段回歸法得到因果效應(yīng)的估計(jì)量。其中第一階段由暴露X對(duì)工具變量Z進(jìn)行回歸，第二階段由結(jié)局Y對(duì)第一階段所得到的暴露估計(jì)值進(jìn)行回歸。當(dāng)結(jié)局為連續(xù)變量且采用線性模型時(shí)，該兩階段回歸法即為兩階段最小二乘法(two stage least square，2SLS)，第二階段回歸時(shí)所得到的回歸系數(shù)即為暴露對(duì)結(jié)局的因果效應(yīng)估計(jì)值[7]。當(dāng)使用多個(gè)遺傳變異作為工具變量時(shí)，2SLS估計(jì)量可以看作各工具變量所對(duì)應(yīng)的系數(shù)比估計(jì)量的加權(quán)平均，其中權(quán)重取各工具變量在第一階段回歸時(shí)與暴露的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。選用系數(shù)比估計(jì)或2SLS估計(jì)要依據(jù)所擁有的樣本數(shù)據(jù)情況來(lái)決定。當(dāng)存在多個(gè)工具變量時(shí)，還可以將多個(gè)遺傳變異整合為一個(gè)加權(quán)或非加權(quán)的等位基因得分(allele score)，或稱為基因風(fēng)險(xiǎn)得分(genetic risk score)，再以得分作為工具變量構(gòu)建MR模型[8-9]。

3.兩樣本MR模型(two-sample MR)

兩樣本MR模型中使用的遺傳變異與暴露的關(guān)聯(lián)關(guān)系統(tǒng)計(jì)量以及遺傳變異與結(jié)局的關(guān)聯(lián)關(guān)系統(tǒng)計(jì)量分別來(lái)源于兩個(gè)獨(dú)立的、不重疊的樣本。模型主要應(yīng)用匯總數(shù)據(jù)作為研究樣本，樣本數(shù)據(jù)中僅包含遺傳變異與暴露及結(jié)局的關(guān)聯(lián)關(guān)系匯總統(tǒng)計(jì)量(包括關(guān)聯(lián)估計(jì)值、標(biāo)準(zhǔn)誤、顯著性P值等)。匯總數(shù)據(jù)一般來(lái)源于基于大樣本的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)，因此保證了兩樣本MR模型對(duì)因果效應(yīng)的估計(jì)具有較高的效能，同時(shí)也提高了研究結(jié)果的可重復(fù)性。

MR模型的局限性及解決方法

應(yīng)用滿足核心假設(shè)的工具變量是MR模型得到有效估計(jì)的必要條件，然而，由GWAS中獲取的絕大部分與暴露具有顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異，并未完全掌握其關(guān)聯(lián)的生物學(xué)機(jī)制，應(yīng)用這些生物學(xué)機(jī)制尚不明確的遺傳變異作為工具變量增加了其違背核心假設(shè)的可能。除工具變量核心假設(shè)外，不同類型的MR方法還有一些特定的前提假設(shè)，當(dāng)假設(shè)違背時(shí)，將會(huì)得到有偏的、不一致的估計(jì)量。以下介紹MR模型在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中面臨的局限性問(wèn)題，以及如何克服這些局限性，從而得到有效的估計(jì)量。

1.弱工具變量問(wèn)題

應(yīng)用強(qiáng)度高的工具變量可以有效提高M(jìn)R模型估計(jì)因果效應(yīng)的精度及效能，而當(dāng)遺傳變異與暴露關(guān)聯(lián)性較弱時(shí)，會(huì)導(dǎo)致MR模型的估計(jì)量產(chǎn)生偏倚，稱之為弱工具變量偏倚。當(dāng)構(gòu)建單樣本MR模型時(shí)，估計(jì)量將會(huì)向受到混雜影響的觀察性研究估計(jì)量的方向偏倚，且會(huì)造成Ⅰ型錯(cuò)誤率(假陽(yáng)性率)膨脹，當(dāng)構(gòu)建兩樣本MR模型且兩個(gè)樣本無(wú)明顯重疊時(shí)，估計(jì)量將會(huì)向效應(yīng)為零的方向偏倚[11]。

在MR模型中，常用Cragg-DonaldF統(tǒng)計(jì)量來(lái)評(píng)價(jià)工具變量的強(qiáng)度，弱工具變量所導(dǎo)致的偏倚大小和該統(tǒng)計(jì)量的期望值是相對(duì)應(yīng)的。一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則是工具變量強(qiáng)度F統(tǒng)計(jì)量至少為10，當(dāng)F小于10時(shí)，因果效應(yīng)的估計(jì)量會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的偏倚[12]。另外，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)量與“工具變量—暴露”的關(guān)聯(lián)顯著性P值是對(duì)應(yīng)的，該P(yáng)值通常作為工具變量的篩選閾值。為了保證模型中工具變量具有足夠的強(qiáng)度，現(xiàn)有MR模型通常將全基因組顯著性水平(P<5×10-8)作為閾值篩選工具變量，從而避免潛在的弱工具變量偏倚[12]。另外，當(dāng)MR模型中工具變量的平均強(qiáng)度較弱時(shí)，還可以應(yīng)用一些改進(jìn)的MR模型，如基于修正權(quán)重的IVW，Egger-SIMEX等模型來(lái)校正潛在的弱工具變量偏倚[13-14]。

2.多效性問(wèn)題

多效性是指遺傳變異通過(guò)多種不同的路徑對(duì)某一性狀產(chǎn)生影響[15]。當(dāng)利用多效性遺傳變異作為工具變量時(shí)，相當(dāng)于構(gòu)造了“工具變量—暴露—結(jié)局”路徑之外的其他通路，從而使得工具變量因違背核心假設(shè)而失效(圖3)。應(yīng)用存在多效性的工具變量會(huì)導(dǎo)致所研究的因果通路的效應(yīng)估計(jì)產(chǎn)生偏倚，Ⅰ型錯(cuò)誤率增加[16]。遺傳變異的多效性效應(yīng)是普遍存在的，而其對(duì)于MR模型的影響又是不可忽略的，因此如何排除多效性效應(yīng)對(duì)于估計(jì)的影響是MR模型在實(shí)際應(yīng)用中不可忽視的問(wèn)題[17]。

圖3 多效性工具變量Z：工具變量；X：暴露；Y：結(jié)局

針對(duì)MR模型的多效性偏倚問(wèn)題，目前的校正方法主要分為兩類：第一類方法首先識(shí)別并排除存在多效性的工具變量，再利用剩余無(wú)多效性的工具變量構(gòu)建MR模型進(jìn)行因果效應(yīng)估計(jì)。可借鑒識(shí)別離群點(diǎn)的思想來(lái)識(shí)別多效性工具變量，其基本思想是：基于有效工具變量得到的比例估計(jì)值應(yīng)是同質(zhì)的，比例估計(jì)值之間的差異應(yīng)是隨機(jī)的。此時(shí)多個(gè)比例估計(jì)值應(yīng)基本分布在一條直線附近，而這條直線的斜率所代表的就是暴露與結(jié)局之間真實(shí)的因果效應(yīng)值。反之，當(dāng)某一工具變量對(duì)應(yīng)的比例估計(jì)值與其他比例估計(jì)值之間存在顯著的異質(zhì)性時(shí)，則提示該工具變量違背核心假設(shè)。比例估計(jì)值之間的異質(zhì)性主要來(lái)源于多效性工具變量，由于多效性效應(yīng)被摻入因果效應(yīng)通路中，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的比例估計(jì)值產(chǎn)生偏倚，從而與其他工具變量所對(duì)應(yīng)的比例估計(jì)值相比體現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性[18]。

實(shí)際研究中，可以通過(guò)散點(diǎn)圖、漏斗圖等可視化方法結(jié)合統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法識(shí)別多效性工具變量。常用的檢驗(yàn)方法包含Q統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)[13，18]、MR-PRESSO異質(zhì)性檢驗(yàn)(mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier)[19]、HEIDI檢驗(yàn)(heterogeneity in dependent instrument)[20]等。識(shí)別并剔除多效性工具變量后，可采用全局Q統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)、全局PRESSO檢驗(yàn)、MR-Egger截距項(xiàng)檢驗(yàn)等方法來(lái)評(píng)價(jià)剩余工具變量的多效性[21]。若剩余工具變量所對(duì)應(yīng)的比例估計(jì)值已不存在異質(zhì)性，則提示無(wú)多效性工具變量，接下來(lái)則可應(yīng)用基于無(wú)多效性工具變量假設(shè)構(gòu)造的MR模型進(jìn)行效應(yīng)估計(jì)[10，22]。

另一類方法為直接采用基于校正多效性偏倚的MR模型進(jìn)行因果效應(yīng)估計(jì)，這類模型允許工具變量存在多效性，在此情況下校正工具變量的多效性效應(yīng)，同時(shí)估計(jì)暴露對(duì)結(jié)局的因果效應(yīng)。基于校正多效性偏倚的MR模型中，基于個(gè)體數(shù)據(jù)的方法包含sisVIVE(some invalid some valid instrumental variable estimator)[23]、TSHT(two-stage hard thresholding)[24]、PRMR(pleiotropy-robust mendelian randomization)[25]等；基于匯總數(shù)據(jù)的方法包含MR-Egger[21]、基于中位數(shù)的估計(jì)(median-based estimate)[26]、基于眾數(shù)的估計(jì)(mode-based estimate)[27]、CAUSE(causal analysis using summary effect estimates)[28]模型等。

具體研究中，常利用基于不同假設(shè)的MR模型進(jìn)行敏感性分析，并比較各種方法所得結(jié)果的差異性，從而評(píng)估研究結(jié)果對(duì)于多效性假設(shè)的穩(wěn)健程度[29]。不同方法所得到的估計(jì)量若是一致的，提示多效性工具變量所引入的潛在偏倚被有效的校正，而不同模型所得到的估計(jì)量若有顯著的差異，則提示現(xiàn)有模型對(duì)于多效性工具變量較為敏感，有必要更進(jìn)一步的進(jìn)行分析與校正[30]。

3.連鎖不平衡問(wèn)題

連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)描述的是遺傳變異之間的相關(guān)性，這種相關(guān)性通常是由遺傳變異之間物理位置的臨近所導(dǎo)致的。遺傳變異之間存在LD時(shí)，每個(gè)遺傳變異提供的信息不獨(dú)立，當(dāng)利用這些不相互獨(dú)立的遺傳變異作為工具變量時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)估計(jì)產(chǎn)生偏倚。因此在構(gòu)建MR模型時(shí)應(yīng)盡量選擇相互獨(dú)立的遺傳變異作為工具變量，而當(dāng)工具變量間存在LD時(shí)，可應(yīng)用納入工具變量相關(guān)性信息的模型，如GSMR(generalized summary data-based MR)[22]，從而避免連鎖不平衡問(wèn)題對(duì)于模型的影響。

4.人群分層問(wèn)題

人群分層是指遺傳變異與表型性狀的關(guān)聯(lián)性在不同種族或者國(guó)家的子群體中的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致遺傳變異作為工具變量無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)于混雜因素的隨機(jī)化過(guò)程，從而產(chǎn)生有偏的效應(yīng)估計(jì)[31]。為了避免人群分層問(wèn)題，在構(gòu)建MR模型時(shí)通常選擇同種族人群作為研究對(duì)象；在統(tǒng)計(jì)分析上，可以針對(duì)潛在的異質(zhì)性因素進(jìn)行分層分析，或利用主成分分析方法進(jìn)行校正，從而排除由于人群分層問(wèn)題導(dǎo)致的虛假關(guān)聯(lián)出現(xiàn)[32]。

5.統(tǒng)計(jì)效能問(wèn)題

MR模型估計(jì)因果效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)效能與納入模型中的工具變量所解釋的暴露變異比例相關(guān)，在樣本含量一定時(shí)，工具變量對(duì)暴露變異的解釋比例越高，模型的統(tǒng)計(jì)效能越高。因此，構(gòu)建MR模型時(shí)要保證工具變量對(duì)于暴露變異的總體解釋比例在一個(gè)較高的水平，從而保證模型具有充足的統(tǒng)計(jì)效能[33]。單個(gè)遺傳變異對(duì)暴露變異的解釋作用通常是很小的，因此現(xiàn)有MR模型通常選定多個(gè)遺傳變異作為工具變量，從而增加工具變量對(duì)于暴露變異的解釋比例，提高估計(jì)的統(tǒng)計(jì)效能。在模型構(gòu)建上，Radial IVW[13]、Three-sample MR[34]、MRMix[35]等模型通過(guò)放寬工具變量與暴露關(guān)聯(lián)的顯著性閾值納入更多的工具變量，同時(shí)校正由于弱工具變量的引入導(dǎo)致的潛在偏倚，從而提高模型的統(tǒng)計(jì)效能與估計(jì)精度。

樣本含量是決定MR模型統(tǒng)計(jì)效能的另外一個(gè)主要因素。遺傳變異的個(gè)體數(shù)據(jù)通常是難以獲取的，并且由于研究經(jīng)費(fèi)限制，單個(gè)研究只包含較小的樣本含量，因此基于個(gè)體數(shù)據(jù)的MR模型統(tǒng)計(jì)效能往往較低。相比之下，基于GWAS的匯總數(shù)據(jù)所構(gòu)建的MR模型在數(shù)據(jù)獲取，成本效率上具有更明顯的優(yōu)勢(shì)，而數(shù)以十萬(wàn)甚至百萬(wàn)計(jì)的樣本含量同時(shí)也保證了估計(jì)具有較高的統(tǒng)計(jì)效能。因此，目前研究大多利用匯總統(tǒng)計(jì)量構(gòu)建MR模型，極大程度上推動(dòng)了不同性狀與疾病之間因果推斷的研究。

另外，在選定工具變量構(gòu)建MR模型進(jìn)行因果效應(yīng)估計(jì)之前，可以根據(jù)數(shù)據(jù)類型、樣本含量、工具變量個(gè)數(shù)等指標(biāo)選取適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)效能先驗(yàn)估計(jì)方法來(lái)預(yù)測(cè)模型的統(tǒng)計(jì)效能[36-38]。

6.結(jié)論外推問(wèn)題

在對(duì)MR模型得到的因果效應(yīng)估計(jì)量進(jìn)行解釋時(shí)，需要注意的一點(diǎn)是，遺傳變異所解釋的暴露變異只是暴露總變異中的一部分，因此利用遺傳變異作為暴露的工具變量來(lái)估計(jì)其對(duì)結(jié)局的因果效應(yīng)，所得到的效應(yīng)值也只是由工具變量所決定的這一部分暴露變異對(duì)結(jié)局的效應(yīng)，而由其他非遺傳因素所決定的暴露變異對(duì)于結(jié)局的效應(yīng)，是無(wú)法通過(guò)MR模型獲得的。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，由MR所得到的暴露對(duì)結(jié)局的效應(yīng)估計(jì)量不能完全等同于真實(shí)的因果效應(yīng)[39]。另外，在設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，工具變量核心假設(shè)滿足的情況下，MR模型可以為暴露與結(jié)局之間是否具有因果關(guān)聯(lián)提供統(tǒng)計(jì)學(xué)上的線索，為后續(xù)更明確的試驗(yàn)研究及機(jī)制探索提供理論依據(jù)，但任何單一的研究方法都無(wú)法完全明確因果關(guān)系。真實(shí)的因果關(guān)聯(lián)應(yīng)結(jié)合疾病的生物學(xué)機(jī)制、完善的試驗(yàn)及臨床研究結(jié)果等多方面證據(jù)綜合進(jìn)行探討[40]。

MR模型的規(guī)范化應(yīng)用報(bào)道

在實(shí)證研究中，構(gòu)建MR模型進(jìn)行因果效應(yīng)估計(jì)主要包含以下步驟：根據(jù)研究設(shè)計(jì)選擇合適的樣本并收集數(shù)據(jù)；選擇與暴露相關(guān)的遺傳變異作為工具變量；根據(jù)樣本數(shù)據(jù)的不同類型(個(gè)體數(shù)據(jù)、匯總數(shù)據(jù))選擇合適的MR模型進(jìn)行估計(jì)與推斷；根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果做出客觀的、合理的解釋。上述步驟中需要注意的問(wèn)題已在第二部分進(jìn)行了詳細(xì)的論述，總結(jié)來(lái)說(shuō)，在構(gòu)建MR模型進(jìn)行實(shí)證研究時(shí)，需要對(duì)模型的假設(shè)及工具變量核心假設(shè)是否滿足進(jìn)行充分的評(píng)估，并對(duì)模型進(jìn)行合理的選擇與正確的應(yīng)用，以確保統(tǒng)計(jì)結(jié)論的有效性。下面以結(jié)果檢查報(bào)告表的形式給出MR模型的應(yīng)用報(bào)道指南。

表1 MR模型結(jié)果報(bào)告檢查表