馬禎一　　錢萍　　俞芳　趙俊　　陳建清

[摘要] 目的 依靠深度學(xué)習(xí)的智能圖像分析對IgA腎病精確檢測及診斷，使臨床采取有效的防治手段，是減少終末期腎病的發(fā)病率及病死率的關(guān)鍵。 方法 選取2016年1月至2019年6月我院腎病科收治的腎病病例共452例，排除因腎穿刺送檢標(biāo)本數(shù)量少，無法出具病理診斷;排除腎穿刺病理診斷疑似診斷者，排除未行免疫熒光檢查患者后，確診IgA腎病患者共135例進(jìn)行圖像分析，采用國際通用5級半定量法評價(jià)，選擇傳統(tǒng)圖像處理方法分割提取熒光沉積區(qū)域。將輸入圖像進(jìn)行顏色空間轉(zhuǎn)換，在顏色和亮度兩個(gè)特征維度，采用自適應(yīng)閾值方法產(chǎn)生二值化圖像。然后使用區(qū)域分離與合并，獲得獨(dú)立的沉積區(qū)域，再計(jì)算各個(gè)沉積區(qū)域的輪廓、面積和平均亮度，得出計(jì)算機(jī)自動識別熒光沉積強(qiáng)度和形狀的過程。 結(jié)果 基于深度學(xué)習(xí)的人工智能圖像分析能實(shí)現(xiàn)對IgA腎病免疫熒光結(jié)果的判讀，與病理診斷醫(yī)生結(jié)果相比符合率較高，IgA達(dá)88.9%，IgG達(dá)85.8%，IgM達(dá)83.8%，C3達(dá)88.6%，因此其可以協(xié)助病理診斷醫(yī)生對IgA腎病免疫熒光的判讀。 結(jié)論 充分利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)改變病理工作流程，提高病理診斷醫(yī)生的工作效率，減少因疲勞閱片發(fā)生的誤診率，使病理診斷更加精準(zhǔn)及客觀。

[關(guān)鍵詞] IgA腎病;免疫熒光;智能圖像分析;深度學(xué)習(xí)

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）09-0147-05

Application of intelligent image analysis in immunofluorescence pathological diagnosis of IgA nephropathy

MA Zhenyi1? ?QIAN Ping1? ?YU Fang1? ?ZHAO Jun1? ?CHEN Jianqing2

1.Department of Pathology，Jiaxing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Jiaxing? ?314001，China;2.Department of Information，Jiaxing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Jiaxing? ?314001，China

[Abstract] Objective It is the key to reduce the incidence and mortality of end-stage renal disease to accurately detect and diagnose IgA nephropathy by relying on intelligent image analysis of deep learning，and to adopt effective prevention and treatment measures in clinic. Methods In this research，a total of 452 nephrotic cases admitted to the department of nephropathy in our hospital from January 2016 to June 2019 were selected. After excluding those because the number of specimens sent for renal puncture was small and pathological diagnosis could not be issued， those with suspected diagnosis of renal puncture pathology and those without immunofluorescence examination， a total of 135 patients with IgA nephropathy were diagnosed for image analysis. Meanwhile，they were evaluated by international five-level semi-quantitative method，and the fluorescence precipitation area was extracted by traditional image processing method. The input image was transformed into color space，and the binary image was generated by adaptive threshold method in the two feature dimensions of color and brightness. Then，independent deposition areas were obtained by region separation and combination，and then the contour， area and average brightness of each deposition area were calculated， and the process of automatic recognition of fluorescence deposition intensity and shape by computer was obtained. Results On the basis of deep learning，artificial intelligence image analysis can realize the interpretation of immunofluorescence results of IgA nephropathy. Compared with the results of pathological diagnosis doctors，the coincidence rate was higher， IgA reached 88.9%，IgG reached 85.8%，IgM reached 83.8% and C3 reached 88.6%. Therefore，it could assist pathological diagnosis doctors in the interpretation of IgA nephropathy immunofluorescence. Conclusion It is time to make full use of computer technology and network technology to change the pathological workflow，improve the work efficiency of pathological diagnosis doctors，reduce the misdiagnosis rate due to fatigue，and make pathological diagnosis more accurate and objective.

[Key words] IgA nephropathy; Immunofluorescence; Intelligent image analysis; Deep learning

IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積，伴系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生為主和補(bǔ)體C3等膜攻擊復(fù)合物（Membrane attack complex，MAC）沉積于腎小球系膜區(qū)的腎小球疾病。在全世界范圍內(nèi)，IgA腎病認(rèn)為是世界上最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，20%～40%的患者在20年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病[1]。所以盡早明確診斷IgA腎病，能夠采取有效的防治手段，是減少終末期腎病的發(fā)病率及病死率的關(guān)鍵之一?，F(xiàn)階段腎活檢組織病理檢查包括光學(xué)檢查、免疫病理檢查及電鏡檢查。而IgA腎病的確診首先依賴于免疫熒光或免疫組化檢查。IgA腎病的免疫學(xué)表現(xiàn)為以IgA為主的腎小球系膜區(qū)或伴有毛細(xì)血管壁的高強(qiáng)度、粗大顆粒狀或團(tuán)塊狀沉積。其是IgA腎病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，并可在一定程度上判斷疾病的預(yù)后，在病理診斷中具有重要價(jià)值。隨著醫(yī)療電子化、云計(jì)算平臺的快速發(fā)展[2]及人工智能影像識別、輔助診斷[3]等方面也開始大量應(yīng)用，本研究也將在此基礎(chǔ)上對135例IgA腎病免疫熒光切片圖像進(jìn)行分析，采用國際通用5級半定量法評價(jià)，選擇傳統(tǒng)圖像處理方法分割提取熒光沉淀區(qū)域。將輸入圖像進(jìn)行色彩空間轉(zhuǎn)換，在顏色和亮度兩個(gè)特征維度，采用自適應(yīng)閾值方法產(chǎn)生二值化圖像。然后使用區(qū)域分離與合并，獲得獨(dú)立的沉積區(qū)域，再計(jì)算各個(gè)沉積區(qū)域的輪廓、面積和平均亮度，得出計(jì)算機(jī)自動識別熒光沉積強(qiáng)度和形狀的過程。本研究旨在評估深度學(xué)習(xí)的人工智能（Artificial intelligence，AI）圖像分析在IgA腎病免疫熒光病理診斷中協(xié)助病理醫(yī)生診斷的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集? 本研究收集2016年1月至2019年6月在我院腎病科收治的腎病病例共452例，以上數(shù)據(jù)作為患者的隱私，在進(jìn)入大數(shù)據(jù)庫前已征得患者的同意，排除因腎穿刺送檢標(biāo)本數(shù)量少，無法出具病理診斷;排除腎穿刺病理診斷疑似診斷者，排除未行免疫熒光檢查患者后，確診IgA腎病患者共135例，獲取免疫熒光圖片1350張作為研究對象，其中IgA、IgG、IgM、C3、C1q每項(xiàng)均攝熒光涂片2張（×200一張，×400一張），包括各項(xiàng)的陽性及陰性圖片。

1.1.2? 病理資料采集? 腎組織免疫熒光檢查包括冰凍切片和石蠟切片。冰凍切片相對石蠟切片而言稍偏厚，細(xì)胞結(jié)構(gòu)重疊或不清[4]，但石蠟雖然能避免冰凍切片較厚的缺點(diǎn)，但染色背景高，特異性差，因此為了減少特異性熒光的減弱，目前仍使用冰凍切片制片。應(yīng)用冰凍切片進(jìn)行直接免疫熒光檢查是腎活檢免疫病理檢查的重要方法[5]。因此，所有腎活檢標(biāo)本恒溫冷凍切片，厚5 μm，采用DAKOU公司直接免疫熒光檢測試劑盒對IgA、IgG、IgM、C3、C1q進(jìn)行檢測，緩沖甘油封片。由于熒光減弱的速度較快，為了不影響對沉積強(qiáng)度、形態(tài)、部位、分布形式的判讀，及時(shí)進(jìn)行攝圖及掃描，以保證智能診斷的準(zhǔn)確性。使用德國萊卡（Leica）DM2500免疫熒光顯微鏡進(jìn)行攝圖存檔及熒光掃描模式下多層掃描獲得清晰圖片。

1.1.3 IgA腎病免疫熒光病理診斷標(biāo)準(zhǔn)? IgA為主在腎小球系膜區(qū)或伴有毛細(xì)血管壁的高強(qiáng)度、團(tuán)塊狀或粗大顆粒狀I(lǐng)gA沉積為IgA腎病。

1.1.4 評價(jià)方式? 沉積強(qiáng)度根據(jù)國際上通用的5級半定量法評價(jià)：即低倍鏡下不顯示熒光、高倍鏡下似乎可見為“-”;低倍鏡下似乎可見、高倍鏡下可見為“+”;低倍鏡下可見、高倍鏡下清晰可見“++”;低倍鏡下可見，高倍鏡下耀眼“+++”;高倍鏡下刺眼“++++”。沉積形態(tài)：連續(xù)線型、不連續(xù)顆粒狀、團(tuán)塊狀、不規(guī)則等。沉積部位：腎小球毛細(xì)血管區(qū)、系膜區(qū)、腎小管基底膜等。熒光的分布方式為局灶、彌漫和節(jié)段。

1.2 方法

1.2.1 人工診斷信息采集? 臨床診斷組由三位高年資腎臟病理醫(yī)師對1350張圖像進(jìn)行判讀，彼此間為互盲，分別給出免疫熒光從沉積強(qiáng)度、形態(tài)、部位、分布形式的診斷結(jié)果，并將2次以上相同診斷結(jié)果作為最終診斷結(jié)果，為臨床診斷組。

1.2.2 觀察指標(biāo)? IgAN臨床診斷組與智能診斷組診斷免疫熒光陽性符合率=智能診斷組陽性符合數(shù)/臨床診斷組陽性符合數(shù)×100%。

1.2.3智能診斷信息采集? 智能診斷[6]組對所有免疫熒光圖像進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再經(jīng)數(shù)據(jù)增廣和增強(qiáng)后，將樣本分成訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測試集，確保三個(gè)樣本之間相互獨(dú)立。事先使用訓(xùn)練集和驗(yàn)證集完成人工智能診斷系統(tǒng)的開發(fā)和調(diào)教，然后將測試集樣本輸入人工智能（AI）診斷系統(tǒng)，獲取智能診斷報(bào)告。①人工智能（AI）診斷系統(tǒng)。采用人工圖像特征設(shè)計(jì)和深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)特征提取相互集成的方法，其開發(fā)和調(diào)教的過程，即為圖像特征設(shè)計(jì)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的開發(fā)以及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)調(diào)整的過程。采用Opencv跨平臺計(jì)算機(jī)視覺和機(jī)器學(xué)習(xí)軟件開發(fā)，在小樣本階段，采用人工圖像特征設(shè)計(jì)方法，主要依據(jù)熒光沉積區(qū)域亮度的色彩差異，采用圖像顏色空間轉(zhuǎn)換，區(qū)域自適應(yīng)閾值算法，分割熒光沉積區(qū)域，然后再采用圖像形態(tài)學(xué)處理，最后提取區(qū)域輪廓（圖1）。②軟件設(shè)計(jì)。智能圖像分析軟件學(xué)習(xí)模型技術(shù)，按密度、反差、形狀等條件對圖像進(jìn)行識別、修正及歸類，還可以對圖像進(jìn)行邊緣提取、色彩識別等，在基于人工圖像特征提取熒光沉積區(qū)域的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了具有一定自動化的沉積區(qū)域標(biāo)注軟件。該軟件可以高效率對大量IgA熒光圖片進(jìn)行標(biāo)注，即標(biāo)注工具事先生成好可能的熒光沉積區(qū)域的邊界，然后人工修正區(qū)域，刪除多余區(qū)域，增加遺漏區(qū)域。在進(jìn)行人工標(biāo)注的同時(shí)，可以同步完成熒光病理分析，提供關(guān)于圖像的分析結(jié)果及數(shù)據(jù)。③深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)。在完成大量人工標(biāo)注的IgA熒光圖片后，可以進(jìn)一步開展基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的熒光沉積區(qū)域提取和分析算法。本研究采用U-Net醫(yī)學(xué)細(xì)胞分割工具作為分割的主要網(wǎng)絡(luò)，并在U-Net主干網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，增加一個(gè)分支網(wǎng)絡(luò)用于對區(qū)域邊緣建模，邊緣建模方式參考CASENet語義邊緣檢測算法。訓(xùn)練過程采用遷移學(xué)習(xí)法，在COCO等公開數(shù)據(jù)集上完成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)訓(xùn)練，然后使用標(biāo)注的IgA數(shù)據(jù)集，采用數(shù)據(jù)增強(qiáng)方式擴(kuò)展集，訓(xùn)練最終的分隔和邊緣提取網(wǎng)絡(luò)。通過提取相關(guān)特征進(jìn)行訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以有效識別輸入的圖像，并按照設(shè)置的圖像進(jìn)行訓(xùn)練、學(xué)習(xí)、分類，使機(jī)器實(shí)現(xiàn)“思考、學(xué)習(xí)和決策” [7]。

2 結(jié)果

2.1 智能標(biāo)準(zhǔn)化

本研究利用深度學(xué)習(xí)模型[8]，通過以深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為主的人工智能技術(shù)建立人工智能診斷系統(tǒng)，對IgA腎病病理診斷的免疫熒光染色標(biāo)本進(jìn)行診斷并描述，統(tǒng)計(jì)出其準(zhǔn)確性、敏感性及特異性，并與臨床診斷組進(jìn)行比較，進(jìn)一步將智能分析系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化。采用人工圖像特征設(shè)計(jì)方法，主要依據(jù)熒光沉積區(qū)域亮度的色彩差異，采用圖像顏色空間轉(zhuǎn)換，區(qū)域自適應(yīng)閾值算法，分割熒光沉積區(qū)域，然后再采用圖像形態(tài)學(xué)處理，最后提取區(qū)域輪廓。通過自動化的沉積區(qū)域標(biāo)注軟件，標(biāo)注事先生成好可能的熒光沉積區(qū)域的邊界，然后人工修正區(qū)域，刪除多余區(qū)域，增加遺漏區(qū)域，最終得出診斷。

2.2 智能診斷組與臨床診斷組診斷符合數(shù)

由表1～5可知，IgA腎病免疫病理學(xué)表現(xiàn)主要為腎小球系膜區(qū)或伴有毛細(xì)血管壁的高強(qiáng)度、粗大顆粒狀或團(tuán)塊狀I(lǐng)gA沉積;約75.5%見IgG沉積;50.3%見IgM沉積，但強(qiáng)度較IgA弱;81.5%見C3沉積，沉積的部位和形狀與IgA相似，無C1q沉積。并且智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷系統(tǒng)[9]通過不斷的深度學(xué)習(xí)，對圖像進(jìn)行分析，與臨床診斷的符合率相比，能夠提供關(guān)于圖像的科學(xué)數(shù)據(jù)較高，IgA達(dá)88.9%，IgG達(dá)85.8%，IgM達(dá)83.8%，C3達(dá)88.6%。由此可見，隨著對深度學(xué)習(xí)和圖像診斷深入研究，在醫(yī)學(xué)圖像處理領(lǐng)域，借助計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理與分析診斷是該領(lǐng)域的前沿研究[10]。

3 討論

采用一系列的熒光圖像訓(xùn)練一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)可以通過提取相關(guān)特征進(jìn)行訓(xùn)練識別，并按照設(shè)置對熒光圖像進(jìn)行分類。通過人工智能診斷系統(tǒng)對IgA腎病病理免疫熒光染色標(biāo)本進(jìn)行診斷研究，對于圖像識別在臨床的應(yīng)用具有一定的意義。在研究過程中發(fā)現(xiàn)多個(gè)因素會影響診斷的準(zhǔn)確率：①免疫熒光劑衰減速度快的特性，需要在完成標(biāo)本制作后快速掃描成圖，1 h內(nèi)攝圖可以提高診斷準(zhǔn)確性;②制片質(zhì)量也會影響診斷的準(zhǔn)確性，特別是切片厚度、熒光沉淀區(qū)覆蓋均勻度均會影響診斷;③系統(tǒng)需對圖像進(jìn)行邊緣提取，色彩識別、亮度等因素一定程度上影響了圖像提取的準(zhǔn)確性，因此需有效控制圖像區(qū)域自適應(yīng)閾值。因此，圖像分析需要根據(jù)病理學(xué)專家的意見調(diào)整算法及參數(shù)，同時(shí)減少干擾因素，這樣才能輔助病理診斷醫(yī)生對IgA腎病免疫熒光的判讀。隨著標(biāo)記數(shù)據(jù)的增多及質(zhì)量的提高，以及智能圖像分析系統(tǒng)的不斷升級優(yōu)化，檢測結(jié)果符合率也將會不斷提高。

目前，人工智能在國內(nèi)外均處于發(fā)展階段[11]，隨著互聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)[12]、云計(jì)算的快速發(fā)展，從最初的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和模糊邏輯，到現(xiàn)在的深度學(xué)習(xí)、圖像探索。由于算法、算力、大數(shù)據(jù)及圖像處理各方面的進(jìn)步，人工智能在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用也十分廣泛。從最初的功能模仿到針對性的深度學(xué)習(xí)，從皮膚鏡圖像黑色素瘤[13]的識別到胸部CT肺結(jié)節(jié)檢測的效能評估[14]，利用計(jì)算機(jī)圖像處理模式識別技術(shù)對醫(yī)學(xué)圖像進(jìn)行分析處理已引起研究人員的廣泛關(guān)注，并取得很大的研究進(jìn)展，在圖像識別領(lǐng)域獲得成功的大量基礎(chǔ)卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（Convolutional neural network，CNN），其算法特別是圖像識別領(lǐng)域獲得大家公認(rèn)，也均應(yīng)用于醫(yī)學(xué)影像的分割與檢測任務(wù)中。深度學(xué)習(xí)算法的提出，給病理切片圖像的研究帶來了新的思路，為該領(lǐng)域注入了新活力[15]。

隨著大數(shù)據(jù)、云計(jì)算等技術(shù)的發(fā)展，人工智能發(fā)展也突飛猛進(jìn)，醫(yī)療輔助診斷領(lǐng)域逐漸開始慢慢興起。深度學(xué)習(xí)由于其易學(xué)性、通用性及高效性而適用于計(jì)算機(jī)輔助醫(yī)療[16]。因此充分利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)改變病理工作流程，提高病理診斷醫(yī)生的工作效率，減少因疲勞閱片發(fā)生的誤診率，使病理診斷更加精準(zhǔn)及客觀[17]，也可以減少診斷結(jié)果因不同觀察人員的主觀感覺不同而產(chǎn)生診斷的誤差[18]。智能分析為病理診斷提供了一系列的定量化指標(biāo)使醫(yī)生的主觀經(jīng)驗(yàn)的影響因素降低，提高了病理診斷的準(zhǔn)確性。智能圖像分析系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是智能化，可以對圖像進(jìn)行分析后提供出計(jì)算機(jī)對于圖像的科學(xué)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果。其還能發(fā)現(xiàn)人眼不易察覺的細(xì)節(jié)，學(xué)習(xí)到更高層面上的特征，從而不斷完善數(shù)字病理診斷知識體系[19]。

雖然人工智能在不斷進(jìn)步、不斷發(fā)展，目前人工智能還是在模仿、實(shí)驗(yàn)和學(xué)習(xí)階段，并未超越或達(dá)到人類的認(rèn)知能力和水平，而且學(xué)習(xí)的分割及特征展示能力有限，因此需要不斷地進(jìn)行學(xué)習(xí)及改進(jìn)。本研究對于數(shù)據(jù)采集限于回顧性病例，因此也存在一定的選擇偏倚，并對于AI診斷的相關(guān)人文倫理、隱私問題、責(zé)任事故劃分等依然沒有定論[20]。病理人工智能是一項(xiàng)極富挑戰(zhàn)性的技術(shù)，涵蓋了廣泛的科學(xué)及技術(shù)，包含了醫(yī)學(xué)診斷、圖像處理、機(jī)器學(xué)習(xí)、復(fù)雜計(jì)算等很多學(xué)科的不同領(lǐng)域。所以需要搭建反應(yīng)快速、操作簡單和能夠智能診斷的信息化系統(tǒng)以滿足病理科在人工智能方面的需求，促進(jìn)人工智能技術(shù)的發(fā)展。

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（收稿日期：2020-10-26）