秦 雪，李 琦，馮 瑞，趙 騫，鄭 鵬

（東北農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

支持細胞（sertoli cell）是睪丸曲細精管內(nèi)唯一的體細胞，在生精過程中具有提供物理和代謝支持、穩(wěn)定微環(huán)境、釋放和分泌激素和營養(yǎng)物質(zhì)等多種功能［1－5］。為了研究睪丸支持細胞在特定條件下的反應和功能，分離提純支持細胞并獲得穩(wěn)定轉染表達綠色熒光蛋白的支持細胞系是目前研究的重點。增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein－N3 plasmid，pEGFP－N3）是一種用于檢測細胞基因表達和蛋白定位的一種小分子蛋白，熒光強度高、不需反應底物和輔助蛋白質(zhì)的修飾即可產(chǎn)生熒光，且對宿主細胞毒副作用小，轉化后細胞可連續(xù)傳代，對受體的生長發(fā)育及功能等均無明顯影響［6－7］；蛋白序列也已經(jīng)明確可以在活細胞和生物體中對目的基因實時示蹤和篩選［8－9］，在研究特定蛋白的定位、轉運及其與宿主間的相互作用等方面均起著重要作用［10］。

試驗分離純化犢牛睪丸支持細胞，利用Lipofectamine2000轉染和G418篩選，希望得到穩(wěn)定整合pEGFP－N3的支持細胞，為進一步研究血睪屏障的形成和支持細胞的生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和主要試劑

犢牛睪丸來源于雙城血清廠。犢牛屠宰放血后，立即無菌操作，割取睪丸，置于4℃生理鹽水中，3 h內(nèi)運回實驗室。

0.1%膠原酶，Sigma公司產(chǎn)品；0.25%胰酶，Amresco公司產(chǎn)品；基礎培養(yǎng)液：DMEM ＋10% 胎牛血清（FBS）＋1% 雙抗；DMEM、FBS，Gibco公司產(chǎn)品；雙抗（每毫升含10 000 U青霉素和10 mg鏈霉素），Biosharp公司產(chǎn)品；兔抗Vimentin多克隆抗體、FITC標記的羊抗兔IgG，Proteintech公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000、G418，Invitrogen公司產(chǎn)品；pEGFP－N3質(zhì)粒，東北農(nóng)業(yè)大學家畜繁殖實驗室保存。

1.2 犢牛睪丸支持細胞的分離純化

將收集的睪丸置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌，取睪丸實質(zhì)組織移入盛有PBS的玻璃皿中撥散，清洗，盡量去除血細胞和間質(zhì)細胞；將獲得的曲精細管移入離心管中，加入10倍體積的膠原酶消化液，室溫消化3～5 min，期間輕輕吹打2～3次，至曲細精管彼此分散開為止，加入5～10 mL PBS，輕輕吹勻后于600 r／min離心2～3 min，去除上清 液，重 復 上 述 消 化 5 ～10 min；然 后1 000 r／min離心5 min，去除上清液，獲得純凈的曲細精管；加入10倍體積的胰酶消化液，室溫消化3～5 min，期間輕輕吹打2～3次，待懸液中看不到微小的曲細精管片段時加入等量的基礎培養(yǎng)液終止消化；用100μm和74μm篩網(wǎng)分別過濾，將過濾后的細胞懸液以1 000 r／min離心5 min，去除上清液，將細胞沉淀重新以基礎培養(yǎng)液懸起，獲得含有生精細胞和支持細胞兩種細胞的生精上皮細胞懸液。

將生精上皮細胞懸液調(diào)整密度為（1～5）×106個／mL，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4～6 h后支持細胞已大部分貼壁，用吸管輕輕吹打，懸起尚未緊密貼壁的生精細胞和部分支持細胞，棄掉培養(yǎng)液，添加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待細胞生長至90%融合時，用PBS清洗2次，用胰酶消化細胞后重新接種培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光染色

待細胞生長至90%融合時，用4%多聚甲醛固定15 min，用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS清洗2次，每次5 min，滴加5% BSA封閉液室溫封閉40 min，棄掉封閉液，加1∶500倍稀釋（含1%BSA的PBS溶液）的兔抗Vimentin多克隆抗體，4℃孵育過夜，使用正常的IgG作為陰性對照。用含0.1% BSA 的PBS溶液清洗2次，每次5 min，加入1∶100稀釋（含1% BSA的PBS溶液）的FITC標記的羊抗兔IgG，室溫避光孵育1 h，再用含0.1% BSA的PBS溶液清洗2次，每次5 min，然后用DAPI復染5 min。PBS清洗3次后，在熒光顯微鏡下觀察和照相。

1.4 轉染pEGFP－N3載體

轉染前24 h將細胞種植在6孔板中。待細胞生長至90%融合時，用無血清的DMEM沖洗細胞，再加入無血清的DMEM 2 mL。取Lipofectamine 2000 3μL和pEGFP－N3重組質(zhì)粒（使用Omega公司的無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取后使用）1μg，分別加入100μL無血清的DMEM 混合均勻，室溫孵育5 min；輕輕混合上述兩種混合物，室溫孵育20 min；均勻吸取混合物緩慢加入6孔板中，37℃、5% CO2孵育細胞6 h，再換成正常培養(yǎng)液；細胞轉染48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白基因的表達情況；小心將細胞消化下來，以1∶5的比例稀釋，接種到6孔板中過夜培養(yǎng)；第2天待細胞貼壁表達蛋白后，以確定好的篩選濃度加入500μg／mL G418，輕柔混勻，每天觀察細胞狀態(tài)，根據(jù)細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基。1周后未轉染的細胞大量死亡，更換維持濃度200μg／mL的G418培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

2 結果

2.1 犢牛睪丸支持細胞的分離純化與鑒定

采用剝離和胰酶消化首先獲得曲細精管，然后采用膠原酶法進行消化，獲得支持細胞和生殖細胞的混合細胞；之后差速貼壁培養(yǎng)，獲得較純潔的支持細胞；更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，獲得原代支持細胞，見圖1。支持細胞進行免疫組化染色，結果表明，培養(yǎng)的細胞表達波形蛋白，支持細胞的純度達到95%以上，見圖2。

圖1 犢牛睪丸支持細胞的體外培養(yǎng)（Bar＝50μm）

圖2 犢牛睪丸支持細胞的免疫熒光染色鑒定（Bar＝50μm）

2.2 犢牛睪丸支持細胞的轉染

轉染48 h后，將細胞以1∶5的比例傳代到新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；第2天加入篩選劑量的G418。1周后未轉染的細胞大量死亡，剩余的為轉染的細胞群，見圖3；更換含維持劑量G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2周后得到穩(wěn)定整合有外源基因的支持細胞克隆，見圖4。

圖3 G418篩選1周的犢牛睪丸支持細胞（Bar＝50μm）

圖4 G418篩選2周的犢牛睪丸支持細胞（Bar＝100μm）

3 討論

隨著對睪丸支持細胞生物學特性研究的逐漸深入，支持細胞的分離方法和程序要求既要操作簡單還要適合在無菌條件下進行。本試驗利用膠原酶和胰酶兩種組合酶前后分別對細胞進行消化，根據(jù)支持細胞和精原細胞生長速度和貼壁時間不一致的特點分離純化支持細胞。在培養(yǎng)4～6 h后將未貼壁的精原細胞去除，從而得到生長狀態(tài)良好、較為純化的犢牛睪丸支持細胞。由于簡化了犢牛睪丸支持細胞的分離和純化步驟，最大限度地避免了睪丸中其他體細胞與各級生精細胞的污染。

目前細胞轉染系統(tǒng)主要有兩大類型，一類是基因整合并持續(xù)穩(wěn)定表達的細胞系，另一類是不產(chǎn)生基因整合的短暫轉染細胞系。轉染使用的方法有很多，如化學轉染法（DEAE葡聚糖法和人工脂質(zhì)體法等）、物理轉染法（電穿孔法和基因槍法等）和病毒介導轉染法［11－12］。每種轉染方法都有各自的特點，轉染效率也不一致，根據(jù)細胞特點以及試驗實際情況可以自行選擇。犢牛睪丸支持細胞是研究雄性動物血睪屏障的一個良好的研究體系。本試驗利用Lipofectamine 2000轉染pEGFPN3載體，轉染48 h后EGFP蛋白仍在細胞中均勻表達，通過G418篩選后得到穩(wěn)定整合有外源基因的犢牛睪丸支持細胞克隆。在試驗中發(fā)現(xiàn)轉染效率低是一個常見問題，這與細胞的生長特性和轉染時的細胞狀態(tài)有密切聯(lián)系。因此，在轉染中為了提高轉染效率，選擇了處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的睪丸支持細胞，盡可能減少細胞暴露時間，還要選擇合適的細胞數(shù)量進行轉染；其次EGFP蛋白在未正確折疊時也不會觀察到熒光，且相對分子質(zhì)量大小的改變可能會影響EGFP生色基團的形成和EGFP的功能，這可能是轉染后少數(shù)細胞中沒有觀察到綠色熒光的原因之一。在今后的研究中，可根據(jù)上述影響外源基因轉染效率的參數(shù)來進一步優(yōu)化pEGFP－N3質(zhì)粒轉染犢牛睪丸支持細胞的條件。

本試驗通過在犢牛睪丸支持細胞中轉染pEGFP－N3載體，經(jīng)過G418篩選后，初步建立了能夠穩(wěn)定表達EGFP的細胞系。然而這種原代細胞隨著篩選次代的增多，細胞會出現(xiàn)衰老的特征，因此需要根據(jù)細胞自身的特質(zhì)在合適的代次中開展研究，本試驗成果將為目標蛋白質(zhì)在犢牛睪丸支持細胞中的功能研究提供理論依據(jù)。