鄒 躍，王 卉，馬南行，關(guān)云霞，李銘桀，翟 赫，鄒吉宇，李?yuàn)櫇桑?琦，曹育涵，楊心茹，張秋華

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)藥理教研室·遼寧 沈陽(yáng) 110847；2大連麥迪醫(yī)療科技有限公司·遼寧 大連 510530)

復(fù)方消渴乳膏依據(jù)《仁齋直指方》之玉泉丸為基礎(chǔ)方藥加減配制而成中藥乳膏制劑，臨床初步觀察證明復(fù)方消渴乳膏能降低糖尿病患者的空腹血糖、餐后血糖和糖化血紅蛋白水平。為了進(jìn)一步證明其藥理作用和作用機(jī)制，本文觀察其對(duì)高脂聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖、血脂、炎癥因子和氧化應(yīng)激的作用，探討其對(duì)糖尿病作用及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J雄性小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京科奧協(xié)力有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于 SPF 級(jí)動(dòng)物房，室溫20 ℃，相對(duì)濕度 40%～60%，每日光照 12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 復(fù)方消渴乳膏：由澳大利亞奧薇納生物制藥有限公司制備。二甲雙胍：中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：H20023370。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)：購(gòu)于Sigma公司，STZ 50 mg溶于0.1 mol/L(pH=4.2)檸檬酸鈉緩沖液，臨用前配制。小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(T-CHO)、糖基化血紅蛋白(GHbA1c)試劑盒：南京建成生物工程研究所；小鼠胰島素(INS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒：江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。高脂飼料(普通飼料77%、蔗糖10%、熟豬油10%、膽固醇2%、膽酸鹽1%)：由北京科奧協(xié)力有限公司制作。

1.4 主要儀器 TP-100臺(tái)式精密天平：佑科FA2004；酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices SpectraMax M2；三諾安穩(wěn)血糖儀；組織切片機(jī)：Leica RM2135，Leica 公司，德國(guó)；光學(xué)顯微鏡：Olympus。

1.5 方法

1.5.1 模型制備、分組和給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，稱重，尾靜脈采血，檢測(cè)空腹血糖(FBG)，然后分為正常對(duì)照組15只(正常飼料)和造模組45只(高脂飼料)，高脂飼料喂養(yǎng)5周，于造模前禁食15 h，按50 mg·kg-1腹腔注射STZ[1]，連續(xù)注射3 d，每周第3天測(cè)定小鼠FBG值，最后FBG≧12 mmol·L-1認(rèn)為糖尿病模型制備成功。造模成功小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、復(fù)方消渴乳膏組、二甲雙胍組，上述3組繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)。復(fù)方消渴乳膏組同時(shí)給予每天0.8 g·kg-1復(fù)方消渴乳膏涂抹四肢內(nèi)側(cè)、腋下、腹股溝處，每天換位；二甲雙胍組每天按0.0875 g·kg-1灌胃給藥；每天分2次給藥，給藥12周。實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄小鼠一般情況，包括活動(dòng)、取食、飲水、精神狀況、毛發(fā)、糞便等，每周測(cè)定FBG并稱重，每?jī)芍軠y(cè)一次糖耐量(OGTT)。

1.5.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定 末次給藥后，禁食12 h，次日清晨小鼠腹腔注射10 %水合氯醛(350 mg·kg-1)，麻醉后，心臟取血，分離血清。然后，取各組小鼠胰腺，10%多聚甲醛固定，用于制備石蠟標(biāo)本。

1.5.2.1 血糖、血脂檢測(cè) 小鼠取血后在4℃條件下3 000 r/min離心10 min，冰上分離血清，按試劑盒說(shuō)明書采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)FBG和糖耐量，糖耐量測(cè)試按0.2 mL/10 g劑量一次性給予小鼠腹腔注射10%葡萄糖溶液，于2 h后，取尾尖血測(cè)定血糖值；按生化試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血中GHbA1c、LDL、HDL、TG、TC含量。

1.5.2.2 胰島素檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)小鼠胰島素水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)。IRI=(空腹胰島素濃度×空腹血糖濃度)/22.5。

1.5.2.3 炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-1β，按試劑盒說(shuō)明書分別以鄰苯三酚自氧化法劑盒法、DTNB比色法和硫代巴比妥酸比色法測(cè)定血中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.5.2.4 胰腺組織病理觀察 取胰腺后，10%甲醛固定，洗滌、脫水、制成蠟塊，切片，烘烤(60 ℃，1 h)，蘇木素-伊紅染色(HE)染色，封片，200 倍鏡下光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0軟件處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)判斷總體顯著性差異，組間資料采用LSD檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響 各組小鼠從第1～17 周體質(zhì)量變化情況如圖1所示，每組小鼠體質(zhì)量總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。造模成功3周后即是從第10～17周各組小鼠體質(zhì)量變化差別明顯，其中與正常組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量從第10～17 周升高趨勢(shì)顯著(P<0.001)。與模型組比較，二甲雙胍組小鼠體質(zhì)量從第11～17周較模型組體質(zhì)量降低(P<0.05，P<0.001)；乳膏組小鼠體質(zhì)量從第12周開(kāi)始較模型組體質(zhì)量降低(P<0.05)，第13～15周降低明顯(P<0.01)，第16周后，體質(zhì)量顯著降低(P<0.001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方消渴乳膏可以減輕小鼠食用高脂飼料誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加的現(xiàn)象。

圖1 各組小鼠第1～17 周體質(zhì)量變化比較

2.2 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠FBG和OGTT的影響 見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠第1～17 周FBG、OGTT變化比較

與正常組比較，模型組小鼠的FBG從第10～17 周顯著升高(P<0.001)，OGTT從第10～17周顯著升高(P<0.001)。與模型組對(duì)比，乳膏組FBG在第12周時(shí)較模型組明顯降低(P<0.01)，第13～17周降低顯著(P<0.001)；乳膏組OGTT在第10周時(shí)較模型組顯著降低(P<0.001)。與模型組對(duì)比，二甲雙胍組FBG在第10周時(shí)較模型組明顯降低(P<0.01)，第11周后較模型組顯著降低(P<0.001)；OGTT從第10周開(kāi)始降低顯著(P<0.05)，第12周后較模型組顯著降低(P<0.001)。結(jié)果表明，復(fù)方消渴乳膏可以顯著降低FBG與OGTT。

2.3 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠GHbA1c、胰島素(INS)和胰島素抵抗指數(shù)(IRI)的影響 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠GHbA1c、INS、IRI比較

2.4 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血脂水平比較

2.5 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠炎癥相關(guān)因子的影響 見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

2.6 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血SOD、GPX活性和MDA含量比較

2.7 復(fù)方消渴乳膏對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織病理變化的影響 正常組胰島形狀規(guī)則，呈圓形或橢圓形團(tuán)索狀，邊界清晰，中央胰島β細(xì)胞分布均勻，排列緊密，胞漿豐富。模型組胰島萎縮，邊緣不整，中央胰島β細(xì)胞稀疏；乳膏組和二甲雙胍組與模型組比較，胰島邊界逐漸清晰。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠胰腺組織病理變化(HE，×200，↓：胰島)

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，基本病機(jī)為陰津虧損、燥熱偏勝，血瘀痰濕之標(biāo)貫穿其中，治療應(yīng)針對(duì)病機(jī)，扶正祛邪。本課題組以《仁齋直指方》之玉泉丸為基礎(chǔ)方藥，在此基礎(chǔ)上加減配制成復(fù)方消渴乳膏，組方為葛根、天花粉、玄參、生地黃、蒼術(shù)、桑葉、姜黃。本方宗消渴病以陰津虧虛為本，痰瘀燥熱為標(biāo)之病機(jī)，立滋陰潤(rùn)燥，和血通脈之法。方中葛根生津止渴、解肌退熱、起陰氣、主消渴為君藥。天花粉清熱瀉火而退五臟郁熱，生津止渴而潤(rùn)五臟之燥；生地黃滋陰清熱、生津止渴、養(yǎng)血潤(rùn)燥，兩者共為臣藥。玄參甘苦咸寒，寒而不峻，潤(rùn)而不膩，上清肺熱，下滋腎陰，中消胃燥；蒼術(shù)健脾燥濕，解郁辟穢，氣味辛烈，強(qiáng)胃健脾，發(fā)谷之氣；兩者共為佐藥。桑葉苦甘性寒，向外疏風(fēng)散熱，向內(nèi)清肺潤(rùn)燥；姜黃苦辛性溫，善行氣和血，通經(jīng)活絡(luò)，內(nèi)入臟腑，外徹皮毛；兩者發(fā)表透皮，外引內(nèi)透，直達(dá)病所，共為使藥。全方眾藥配合，共奏養(yǎng)陰生津、止渴除煩、和血通脈、化痰調(diào)中之功效，適用于消渴病之上中下三消及氣血周流不暢諸證。

口服降糖藥藥理機(jī)制明確，降糖效果明顯，多數(shù)患者一經(jīng)確診，口服即可降糖。然而，糖尿病是涉及全身的代謝性疾病，使用單一的口服降糖西藥很難取得長(zhǎng)久而理想的療效。一方面，糖尿病患者體質(zhì)各異，對(duì)某類或某幾類降糖藥物不敏感或因?yàn)樗幬锊涣挤磻?yīng)不能耐受，另一方面，糖尿病屬慢性進(jìn)展性疾病，隨著病程的延長(zhǎng)，病情逐漸加重，血糖有逐漸升高的趨勢(shì)，血糖控制難度逐漸增大，使用單一降糖藥物很難獲得理想的血糖控制效果，所以近年糖尿病及其并發(fā)癥的治療多用復(fù)方制劑。中藥具有毒副作用小、作用溫和而持久的特點(diǎn)，擅長(zhǎng)多靶點(diǎn)的綜合性調(diào)理并延緩并發(fā)癥的發(fā)展。復(fù)方消渴乳膏經(jīng)皮給藥可以避免胃腸道對(duì)藥物的降解，延長(zhǎng)給藥間隔，減少給藥次數(shù)，降低藥物毒副作用，維持恒定血藥濃度和藥理效應(yīng)[2]。若與降糖西藥聯(lián)合，更符合糖尿病的病機(jī)特點(diǎn)和防治要求。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：應(yīng)用復(fù)方消渴乳膏12周后，高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠體質(zhì)量與模型組小鼠比較有顯著性的差異，復(fù)方消渴乳膏可以降低糖尿病小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)、糖基化血紅蛋白，提高胰島素、降低胰島素抵抗指數(shù)，改善胰腺病理改變，從而調(diào)節(jié)糖尿病引起的糖代謝紊亂。血脂檢測(cè)顯示復(fù)方消渴乳膏降低糖尿病小鼠TC、TG的水平；證明復(fù)方消渴乳膏可以調(diào)節(jié)脂代謝、調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的脂代謝紊亂。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)展重要危險(xiǎn)因素。胰島素不足和高血糖通過(guò)ROS介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)一步增加對(duì)糖尿病的損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的最終產(chǎn)物，對(duì)DNA和蛋白質(zhì)都有毒性作用，在氧化應(yīng)激條件下血液和器官中MDA水平升高。很多的研究表明，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠或小鼠體內(nèi)SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平增高[3]。本研究中，高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠表現(xiàn)為SOD和GSH-P活性降低，MDA含量升高；復(fù)方消渴乳膏組小鼠GPX與SOD活性提高，證明復(fù)方消渴乳膏可以對(duì)抗高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ的糖尿病小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

胰島素抵抗(IR)是指胰島素對(duì)其靶組織的效應(yīng)降低，IR與激活NF-κB通路產(chǎn)生炎癥有關(guān)，而高血糖又可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞IR，形成惡性循環(huán)[4]。同時(shí)IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子可以誘發(fā)IR，其水平愈高則發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的幾率越大，患者病情越嚴(yán)重[5]。IL-1β是單核細(xì)胞表達(dá)的重要免疫調(diào)節(jié)劑，可對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性[6]。1型糖尿病臨床試驗(yàn)提示IL-1β抑制可誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞的保存[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方消渴乳膏組小鼠相較于糖尿病組小鼠IRI下降，IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子較糖尿病模型組小鼠也降低，可以看出復(fù)方消渴乳膏有降低IRI，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子改善胰島素抵抗的作用。

綜上所述，復(fù)方消渴乳膏能防治高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠的糖脂毒性、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對(duì)防治糖尿病有一定療效。