童海東，陳 驊

(中國人民武裝警察部隊海警總隊醫(yī)院燒傷科·浙江 嘉興 314000)

燒傷包括火焰、熱蒸汽燒傷以及電燒傷、化學(xué)品燒傷，具有較高的致殘、致死率。深I(lǐng)I度燒傷在臨床上較為多見，并且治療結(jié)局變數(shù)較大。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面局部血供、氧供不足而誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是影響創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因素[1-2]，為新型燒傷治療藥物開發(fā)提供了靶點。芹菜素(Apigenin，APG)是廣泛存在于蔬菜和水果中的一種黃酮類化合物，以芹菜中含量最高，具有抑制炎癥反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激損傷的藥理學(xué)作用[3-4]。本研究旨在探討APG對深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面氧化應(yīng)激和炎癥的作用及其機制。

1 材料

1.1 實驗動物 50只清潔級SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200 g～240 g，由河北省實驗動物中心提供[SCXK(冀)2018-004]。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(25±1)℃、相對濕度(60±5)%、光照黑暗各12 h交替。

1.2 藥物與試劑 APG：陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度≥98%；乳酸鈉林格注射液：石家莊四藥有限公司。TUNEL試劑盒和MDA、SOD、GSH-Px、MPO試劑盒：南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、NF-κB抗體和DAB免疫組化染色試劑盒：北京博奧森生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器 YLS-5Q型燙傷儀：天津科技發(fā)展有限公司；RM2235 型石蠟切片機：德國Leica公司；SE300型電泳儀和TE22型轉(zhuǎn)膜儀：美國Hoefer公司；Muhiskan FC型酶標(biāo)儀：美國Ameritech公司；UV762型紫外-可見分光光度計：上海楚定分析儀器有限公司；CKX41型光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥 將50只大鼠隨機分為假燒傷組，模型組，APG低、中、高劑量[12.5、25.0、50.0 mg/(kg·d)]組，各10只；實驗前12 h禁食水。深I(lǐng)I度燒傷大鼠模型制備參照文獻(xiàn)[5]：實施麻醉，剃除背部毛發(fā)后通過硫化鈉溶液(濃度8%)脫毛，根據(jù)公式S=K·W2/3[S為體表面積(cm2)、W為體質(zhì)量(g)、K=0.091]計算體表面積[6]；燙傷儀于背部脫毛處皮膚加壓0.03 MPa、溫度106 ℃持續(xù)5 s制備深I(lǐng)I度30%燒傷大鼠模型，然后立即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液以抗休克。成模標(biāo)準(zhǔn)：真皮層內(nèi)細(xì)胞部分壞死，毛囊和汗腺等皮膚附件組織結(jié)構(gòu)完整。假燒傷組大鼠脫毛后即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液。APG低、中、高劑量組分別腹腔注射濃度6.25、12.5、25.0 g/L芹菜素溶液(注射劑量2 mL/kg)，假燒傷組和模型組大鼠2 mL/kg同步給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 燒傷創(chuàng)面愈合率檢測及含水量計算 末次給藥24 h后，通過圖像分析系統(tǒng)計算創(chuàng)面面積，計算公式：創(chuàng)面愈合率(%)=(1-未愈創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積)×100%。然后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血并1 500 r/min離心10 min取血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z；頸椎脫臼處死大鼠后，取皮膚創(chuàng)面組織并用生理鹽水沖洗干凈。取每只大鼠部分皮膚創(chuàng)面組織稱重記為W1，烘烤至恒重后再次稱重記為W2，燒傷創(chuàng)面含水量計算公式：含水量(%)= [(W1-W2)/W1]×100%。

2.2.2 創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察和細(xì)胞凋亡觀察 取每只大鼠部分皮膚創(chuàng)面組織，經(jīng)多聚甲醛溶液(濃度為4%)固定、包埋、切片后，部分切片行HE染色，封片后通過顯微鏡觀察創(chuàng)面組織病理學(xué)改變。剩余切片行TUNEL染色，封片后通過顯微鏡觀察創(chuàng)面細(xì)胞凋亡狀況；凋亡指數(shù)(AI)計算公式：AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%

2.2.3 創(chuàng)面組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取每只大鼠剩余的皮膚創(chuàng)面組織，剪碎后加入適量冷裂解液、冰上靜置30 min后研磨勻漿，1 500 r/min離心10 min后取上清液，按照各試劑盒操作說明，通過紫外-可見分光光度計檢測MDA含量和SOD、GSH-Px、MPO活性。

2.2.4 創(chuàng)面組織p-Akt、Nrf2、NF-κB蛋白表達(dá)的Western Blot檢測 取2.2.4制備的各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿液，12 000 r/min離心20 min(恒低溫4℃)取上清液，檢測蛋白濃度后上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后滴加目標(biāo)蛋白和β-actin一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后，DAB試劑盒顯影檢測，以目的條帶與β-actin(內(nèi)參)條帶灰度值比值進行半定量分析。

2.2.5 血清炎性因子檢測 取2.2.1制備的各組大鼠血清，采用ELISA法，通過酶標(biāo)儀檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率和含水量比較 見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率和含水量的比較

3.2 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察結(jié)果 假燒傷組大鼠創(chuàng)面皮膚組織未見異常；模型組創(chuàng)面真皮下層組織水腫、膠原纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變；APG低、中、高劑量組上述病理學(xué)改變呈不同程度改善，其中APG高劑量組真皮下層組織水腫明顯減輕、汗腺和皮脂腺結(jié)構(gòu)完整、炎性細(xì)胞明顯減少、皮?？梢姟Ｒ妶D1。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)改變(HE，×100)

3.3 各組大鼠創(chuàng)面細(xì)胞凋亡比較 假燒傷組可見少量凋亡細(xì)胞；與假燒傷組比較，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，AI顯著升高[(52.03±8.47)%VS(4.15±1.36)%，P<0.01]；與模型組比較，APG低、中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，AI顯著降低[(44.17±6.82)%、(31.59±4.93)%、(24.60±4.48)%VS(52.03±8.47)%，P<0.05或P<0.01]。見圖2。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL，×200)

3.4 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA含量和SOD、GSH-Px、MPO活性比較 見表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA含量和SOD、GSH-Px、MPO活性比較

3.5 各組大鼠創(chuàng)面組織p-Akt、Nrf2、NF-κB蛋白表達(dá)比較 見圖3和表3。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB、Nrf2、p-Akt蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織p-Akt、Nrf2、NF-κB蛋白表達(dá)比較

3.6 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

4 討論

根據(jù)“三度四分法”分級，深I(lǐng)I度燒傷傷及真皮網(wǎng)層，但毛囊、汗腺等皮膚附件組織并未完全損傷，如果處理不及時或治療不當(dāng)則可能誘發(fā)感染，從而導(dǎo)致創(chuàng)面加深，增加治療難度和死亡率[7]。APG是天然存在的一種具有多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG治療能夠明顯提高燒傷創(chuàng)面愈合率、降低創(chuàng)面組織含水量，減輕創(chuàng)面組織病變，降低創(chuàng)面細(xì)胞凋亡率，說明APG具有促進深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合的作用。

燒傷具有較為復(fù)雜的病理機制，其中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在燒傷疾病進展過程中發(fā)揮著重要作用。王瑩等[8]研究發(fā)現(xiàn)燒傷創(chuàng)面血管受損使血供、氧供不足，導(dǎo)致活性氧片段(ROS)過量生成進而引發(fā)創(chuàng)面組織水腫和炎癥反應(yīng)，阻滯修復(fù)細(xì)胞增殖而減緩創(chuàng)面愈合。鞏文藝等[9]、劉馳星等[10]和王黎麗等[11]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)能夠減輕燒傷所致心、肺、腎臟損傷；SOD和GSH-Px是機體還原清除ROS的關(guān)鍵抗氧化酶，SOD和GSH-Px活性降低致使ROS不能及時被清除，ROS則將攻擊生物膜、DNA、蛋白質(zhì)等并生成具有生物毒性的MDA[12]。MPO是一種具有ROS清除作用的過氧化氫酶。燒傷將刺激創(chuàng)面組織大量釋放炎性介質(zhì)，其中TNF-α、IL-1β、IL-6不但能夠引發(fā)炎癥反應(yīng)，并且做為炎癥趨化因子能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞合成與釋放炎性介質(zhì)而形成“炎癥級聯(lián)反應(yīng)”，進一步加重創(chuàng)面損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG治療14d能夠顯著提高SOD、GSH-Px、MPO活性并降低MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，提示APG具有抑制深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用。

Akt被誘導(dǎo)磷酸化(p-Akt)激活后，能夠誘導(dǎo)下游基因Nrf2與抑制劑Keap1解離，并促進Nrf2核轉(zhuǎn)位，進而誘導(dǎo)抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)和血紅素氧合酶1(HO-1)轉(zhuǎn)錄表達(dá)[14]，進而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。HO-1對NF-κB活化具有抑制作用，而NF-κB能夠誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介質(zhì)合成與釋放，任國強等[15]研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB表達(dá)能夠明顯抑制炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APG治療14d能夠顯著上調(diào)p-Akt、Nrf2蛋白表達(dá)并下調(diào)NF-κB表達(dá)，提示APG激活A(yù)kt/Nrf2通路和下調(diào)NF-κB表達(dá)可能是其抑制深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)作用的重要機制。

綜上所述，APG具有抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而促進深I(lǐng)I度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合的作用，作用機制可能與激活A(yù)kt/Nrf2通路、下調(diào)NF-κB表達(dá)有關(guān)。