王 輝，陳 強(qiáng)，李海波，張占琴

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.疼痛科；2.心血管外科；3.心血管內(nèi)科；4.麻醉手術(shù)部&腦科學(xué)中心，陜西西安 710061)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，占腦細(xì)胞的10%～15%，在CNS穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在缺血性腦損傷、膿毒癥腦損傷以及神經(jīng)退行性病變等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用[2]。核因子-κB調(diào)節(jié)蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein 3, TNFAIP3/A20)能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，小膠質(zhì)細(xì)胞A20缺陷后放大脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷以及NLRP3炎癥體激活，加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)[3]。脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是良好的胰島素增敏劑、抗炎調(diào)節(jié)劑和抗動脈粥樣硬化分子。最近研究證實(shí)，APN作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，不僅在代謝性疾病中發(fā)揮抗炎作用[4]，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對炎癥反應(yīng)同樣具有抑制作用[5]。本研究探討了APN是否通過A20/NLRP3/胱冬肽酶-1(caspase-1)途徑抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為APN治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑SD孕鼠購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，所有動物實(shí)驗(yàn)均遵循國家制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用指南，并通過西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO)和LPS(來源于Escherichia Coli O55：B5)(美國Sigma公司)，APN(以色列ProSpec公司)，TNF-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)，A20抗體(美國Santa Cruz公司)，Cd11b、NeuN、NLRP3和caspase-1抗體(美國Abcam公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2 原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的分離培養(yǎng)和鑒定取新生SD大鼠大腦皮層，胰酶消化及細(xì)胞篩過濾后種植于培養(yǎng)瓶中。①加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 d后，分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體Cd11b鑒定細(xì)胞純度，當(dāng)純度>95%時，可分組干預(yù)；②加入含有2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長，培養(yǎng)7～10 d，用神經(jīng)元特異性抗體NeuN鑒定細(xì)胞純度。

1.3 siRNA實(shí)驗(yàn)原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)24 h后，使用control(sc-37007)或A20(sc-37656)siRNA 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行處理。6～8 μg A20或者control siRNA加入無血清DMEM培養(yǎng)基37 ℃孵育細(xì)胞5 h后，換成DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h待用。

1.4 分組與處理原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，純化培養(yǎng)24 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃閮刹糠郑孩貱ontrol組、LPS組、APN組和LPS+APN組。Control組加入等體積的PBS溶劑，LPS組LPS(100 ng/mL)[6]處理24 h，APN組在處理前(無LPS處理)1 h加入APN(10 μg/mL)[7]，LPS+APN組在LPS處理前1 h加入APN。②Control siRNA組、A20 siRNA組、Control siRNA+LPS組和A20 siRNA+LPS組。所有組別在LPS或者對照溶劑處理前1 h加入APN。Control siRNA組使用control siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，A20 siRNA組使用A20 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，control siRNA+LPS組在control siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后LPS處理24 h，A20 siRNA+LPS組在A20 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后LPS處理24 h。

1.5 實(shí)時定量PCR(q-PCR)法檢測各組細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平將原代小膠質(zhì)細(xì)胞分為4組(control、APN、LPS和LPS+APN組)種植于6孔板，給予相應(yīng)的處理后，Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照q-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和q-PCR分析，檢測細(xì)胞TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)。所采用的引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，預(yù)熱變性；95 ℃ 10 s，變性；60 ℃ 30 s，退火；72 ℃，延伸1 min，共40個循環(huán)。基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCT法進(jìn)行計算，結(jié)果以目的基因與β-actin mRNA表達(dá)值的比值表示。

表1 各組細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

1.6 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌情況LPS干預(yù)24 h后收取各組細(xì)胞上清，測定各組細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的分泌量，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元活力的影響原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞24 h建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，應(yīng)用Transwell小室共培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元(1∶2.5)，上室接種小膠質(zhì)細(xì)胞，下室接種神經(jīng)元，共培養(yǎng)48 h。按照試劑盒說明書，通過MTT法檢測神經(jīng)元的存活率，每組設(shè)5個復(fù)孔。用酶標(biāo)儀490 nm吸光度值計算細(xì)胞相對存活率，細(xì)胞相對存活率=(給藥-空白)/(陰性對照-空白)×100%。

1.8 免疫印跡法檢測A20、NLRP3和caspase-1的表達(dá)將原代小膠質(zhì)細(xì)胞分為4組(Control、APN、LPS和LPS+APN組)種植于6孔板，給予相應(yīng)的處理后RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉1 h?？笰20(1∶200)、抗NLRP3(1∶1 000)、抗caspase-1(1∶1 000)或抗β-actin(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h及洗膜后，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行灰度值分析，相對蛋白表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值表示。

2 結(jié) 果

2.1 APN對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響與Control組相比，APN組小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變，LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)；LPS+APN組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α(P<0.05)和IL-1β(P<0.01)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平較LPS組明顯降低(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞中TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)

2.2 APN對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β分泌量的影響與Control組相比，APN組小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的分泌量無明顯改變，LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA分泌量升高(P<0.01)；LPS+APN組小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌量較LPS組明顯降低(P<0.01，圖2)。

圖2 各組細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的分泌量

2.3 APN處理LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元活力的影響LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞24 h建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，應(yīng)用Transwell小室共培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，觀察各組小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元活力的影響(圖3A)。Control組、APN組、LPS組和LPS+APN組神經(jīng)元相對存活率分別為(98.63±1.42)%、(98.86±1.01)%、(54.32±7.16)%、(71.74±10.03)%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。

圖3 APN處理小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元活力的影響

2.4 APN對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞A20、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)的影響與control組相比，APN組小膠質(zhì)細(xì)胞A20、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)無明顯改變，LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞A20、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；而與LPS組相比，LPS+APN組小膠質(zhì)細(xì)胞A20蛋白表達(dá)明顯增加，NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)降低(P<0.01，圖4)。

圖4 Western blotting法檢測A20、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)

2.5 APN通過A20抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)與control siRNA組相比，A20 siRNA組A20表達(dá)明顯降低、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)無明顯改變，control siRNA+LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞A20、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；而與control siRNA + LPS組相比，A20 siRNA+LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞A20蛋白表達(dá)降低、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)增高(P<0.01，圖5)。

圖5 Western blotting法檢測A20、NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其釋放的細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β等)可通過改變神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和降低神經(jīng)細(xì)胞活力促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及炎癥因子釋放是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的重點(diǎn)。新近研究發(fā)現(xiàn)，APN能促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子含量增加，減少炎性細(xì)胞因子的數(shù)量，發(fā)揮抗炎作用，從而避免過度免疫反應(yīng)[9-11]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，APN通過調(diào)控海馬線粒體氧化應(yīng)激和凋亡抑制膿毒癥引起的腦損傷[12]，但其機(jī)制尚不明確。

A20是相對分子質(zhì)量約80 000的胞內(nèi)鋅指蛋白，同時又是重要的負(fù)性炎癥調(diào)節(jié)因子，相較于其他神經(jīng)細(xì)胞，A20蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)[3]，A20缺失導(dǎo)致NF-κB蛋白表達(dá)顯著增高[13]。TNF-α和IL-1β是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病有關(guān)的主要細(xì)胞因子，在炎癥早期主要由小膠質(zhì)細(xì)胞分泌并啟動細(xì)胞因子瀑布，而NF-κB在細(xì)胞因子瀑布的調(diào)節(jié)中起重要作用，它能夠調(diào)節(jié)TNF-α和IL-1β的表達(dá)及分泌[14]。本研究中，APN能抑制這兩種細(xì)胞因子的分泌，提示APN可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β來調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病。在本研究中，體外LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后A20表達(dá)增加，這與以往的研究相似。APN干預(yù)后明顯增加LPS誘導(dǎo)的A20蛋白表達(dá)，而細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的mRNA和細(xì)胞分泌量則明顯降低，表明APN通過上調(diào)A20蛋白表達(dá)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β。

炎性小體的過度激活可導(dǎo)致感染、自身免疫病和神經(jīng)退行性病變等，但對于抑制炎性小體活性的機(jī)制研究仍然欠缺。之前的研究發(fā)現(xiàn)，A20是NF-κB的抑制因子，同時還是一種泛素化修飾酶，它不僅調(diào)控腦脊髓炎模型小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥小體激活和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[3]，而且刪除A20可引起巨噬細(xì)胞NF-κB依賴的NLRP3炎癥小體激活和神經(jīng)炎癥[15]。NLRP3是炎癥體家族成員之一，通過活化caspase-1來間接調(diào)控IL-1β和IL-18的成熟和分泌[16]。Caspase-1又稱IL-1β轉(zhuǎn)化酶，是caspase家族中與炎癥密切相關(guān)的主要成員之一，通過激活炎癥因子IL-1β并促進(jìn)其釋放參與調(diào)控蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等，從而放大炎癥反應(yīng)，加重神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[17]。有研究表明，APN與調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體介導(dǎo)炎癥有關(guān)[18-19]，但其確切的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，使用APN預(yù)先干預(yù)，在明顯降低小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和分泌量的同時降低A20 、NLRP3及caspase-1蛋白含量，提示APN對小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控可能與降低TNF-α和IL-1β含量以及抑制NLRP3炎性小體活性有關(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本研究的創(chuàng)新之處在于，探索了APN抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)分子機(jī)制，揭示其作用可能是通過誘導(dǎo)A20表達(dá)抑制NLRP3炎性小體激活來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究采用APN干預(yù)上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞A20蛋白的表達(dá)，從而阻斷LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)和NLRP3炎性小體激活，揭示了APN抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)與A20/NLRP3/caspase-1信號通路有關(guān)。但作為一種新型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥抑制因子，APN抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制仍不完善，值得進(jìn)一步研究。